赤道几内亚比奥科岛恶性疟原虫msp―1和msp―2基因多态性研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 赤道几内亚比奥科岛恶性疟原虫 MSP1 和 MSP2 基因多态性研究 摘要目的 研究赤道几内亚比奥 科岛（Bioko Island）恶性疟原虫分离株 裂殖子表面蛋白 1（PfMSP-1）基因和 裂殖子表面蛋白 2（PfMSP-2）基因分 型。方法 从比奥科岛采集疟疾患者血 样 181 份，用显微镜法和荧光定量 PCR 鉴定虫种。采用巢式 PCR 分别扩增 PfMSP-1 和 PfMSP-2 中具有型特异性的 片段，进行等位基因分型。结果 PfMSP-1 基因分型：181 份恶性疟患者 血样中有 178 份扩增出 PfMSP-1 基因片 段（98.34%） ，其中 K1、MAD20 和 RO33 基因型片段分别为 171 份（94.48%） 、 175 份（96.69%）和 126 份（69.61%） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 混合感染率为 97.24%；PfMSP-2 基因 分型：181 份血样中有 173 份 PfMSP-2 基因片段（95.58%） ，其中 48 份 （26.52%）单独扩增到 3D7 型基因片 段，4 份（2.21%）单独扩增到 FC27 型基因片段，混合感染率为 66.85%。 结论 赤道几内亚比奥科岛 PfMSP-1 和 PfMSP-2 等位基因型分布范围极广。混 合感染是比奥科岛疟疾的主要类型。 中国论文网 /6/view-12962286.htm 关键词 恶性疟原虫；裂殖子表 面蛋白 1；裂殖子表面蛋白 2；比奥科 岛 中图分类号 R382.3+1 文献标 识码 A 文章编号 1674-4721（2017） 05（a）-0009-04 AbstractObjective To study the type of Plasmodium falciparum MSP-1 （PfMSP-1） and PfMSP-2 gene in Bioko Island of Equatorial Guinea.Methods 181 blood samples were collected from patients with malaria in -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 Bioko Island.Microscopy and fluorescence quantitative PCR were used to identify the insect species.Nested PCR was used to amplify the specific fragment of PfMSP-1 and PfMSP-2 respectively， then the allele typing was conducted.Results PfMSP-1 genotypes：178 （98.34%） PfMSP-1 gene fragments were amplified from the 181 blood samples.MAD20-type，K1- type and RO33-type alleles were obtained from 171 （ 94.48%） ，175 （96.69%） and 126 （69.61%） samples respectively.The mixed infection rate was 97.24%.PfMSP-2 genotypes：173 （95.58%） PfMSP-2 gene fragments were amplified from the 181 blood samples of patients.Single 3D7-type and single FC27-type alleles were obtained in 8 （26.52% ） and 4 （2.21% ） samples respectively.The mixed infection rate was 66.85%.Conclusion PfMSP-1 and PfMSP-2 from Bioko Island are -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 widespread.Mixed infection is the main type of malaria in Bioko Island. Key wordsPlasmodium falciparum；Merozoite surface protein- 1；Merozoite surface protein-2；Bioko Island 疾是严重危害人类健康和影 响经济发展的虫媒传染病，在热带、亚 热带以及温带部分地区广泛流行。疟疾 主要分布于非洲的撒哈拉沙漠以南地区、 东南亚以及加勒比海地区1。全世界每 年约有 2 亿疟疾新发病例，导致约 50 万人死亡。非州中部的赤道几内亚共和 国是全球疟疾感染最为严重的地区之一， 该国绝大多数的疟疾病例是由恶性原虫 感染导致的2。近五年来，尽管赤道几 内亚的卫生部门实施了强有力的疟疾防 控计划，但该地区的疟疾患病率仍然居 高不下3。疟原虫的基因多态性是造成 该地区防控措施进展缓慢的主要障碍之 一3，因此，迫切需要我们去了解恶性 疟原虫的临床分离株的基因多样性。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1（PfMSP-1）和 2（PfMSP-2）是疟原 虫裂殖子表面蛋白家族中的两个重要成 员4，同时也是疟原虫裂殖子表面的两 个非常重要的抗原，在疟原虫裂殖子侵 袭红细胞时发挥重要的作用5，并能诱 导宿主产生免疫应答反应，并被认为是 极有希望发展出无性红内期重要的候选 疫苗的组分5-6，因此用 PfMSP-1 和 PfMSP-2 作为分子标记，在疟疾分子流 行病学研究上具有重要价值。一直以来， 世界各地研究人员对 PfMSP-1 和 PfMSP-2 的基因多态性做了许多研究 5，7-8，但目前未见任何关于赤道几 内亚恶性疟原虫种群的 MSP1 和 MSP2 基因做了分型研究，为了解该岛恶性疟 原虫虫株的基因类型和疟疾的分子流行 病学研究和针对性的疫苗制备提供科学 依据。 1 材料与方法 1.1 血液样本 2011 年 1 月2014 年 12 月，从 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 赤道几内亚比奥科岛不同地区就诊于马 拉博地区医院和地区诊断性诊所的患者 中总共收集了 181 份恶性疟原虫感染血 液样本。该研究得到马拉博地区医院 （Malabo Regional Hospital）伦理委员 会同意，同时取得每例患者的知情同意。 1.2 疟原虫的鉴别和虫密度计算 采用 WHO 推荐的白细胞疟原虫 计数法，在油镜下对吉姆沙染色后血涂 片进行镜检。按照本实验室以往建立定 量 PCR 及熔解曲线的方法进行虫种鉴 定9，同时以四种疟原虫（间日疟原虫、 三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫） 的质粒为参照物。 1.3 基因组 DNA（gDNA）的提 取 寄生虫的 gDNA 由利用 Chelex- 100 提取方法9。用打孔器取直径 5 mm 干血斑，置于 1.5 ml 离心管，先加 入 l ml 的无菌水浸泡 2 h，然后 16 000 r/min，离心 5 min，弃上清；再加 160 l的 5% 的 Chelex-100 混悬液，56 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 加热 2 h，95变性 8 min，振荡 30 s，16 000 r/min，离心 5 min，吸取上清， -20保存备用。 1.4 PfMSP-1 和 PfMSP-2 基因的 分型 按照 PlasmoDB（ http：/） ，基 因 ID 为 PF3D7_0930300 and PF3D7_0206800 的 PfMSP-1 和 PfMSP-2 序列合成各自的巢式 PCR 引物（表 1） 10。根据 PfMSP-1 基因 2、3 区重复 序列数量和毗连序列类型的差异，可分 为 K1，RO33，MAD20 三个基因型； 根据 PfMSP-2 基因 3 区的部分片段，可 分为 3D7 和 FC27 两个基因型。首先使 用公用外部引物进行 PCR 扩增，接下 来使用匹配于 PfMSP-1 三个基因型和 PfMSP-2 两个基因型的特异性引物分别 进行扩增。第 1 次扩增反应用 2 l上述 制备的 DNA 作模板，第 2 次扩增反应 用 2 l 第 1 次的反应产物作模板，其 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 反应体系总体积为 50 l，其中含 DNA 模板 2 l， 20 pmol/l上下游引物各 1 l，1 l的 Taq 聚合酶（东盛生物技术 公司，广州） 、10Buffer（Mg2+Plus） 5 l、dNTP Mixture（各 2.5 nm）4 l、 水 36 l；在伯乐 Mini MJ PCR 仪上进 行试验，PCR 反应条件如下：95变性 3 min，93 30 s-52 30 s-72 延伸 1 min（35 个循环） ；72延伸 5 min。反 应结束后，取 10 l PCR 产物于 2%琼脂 糖电泳和 EB 染色后，用紫外分析仪观 察结果并拍照。PCR 产物的大小根据 25700 bp 的 DNA Marker（东盛生物 技术公司，广州）进行估算，PCR 产物 之间长度20 bp 划分为不同基因类别。 2 结果 2.1 PfMSP-1 基因分型结果 181 份恶性疟疾患者的血样经巢 式 PCR 扩增 PfMSP-1 基因片段，阳性 结果 178 份（98.34%） （表 2） ，其中 K1 等位株 171 份（94.48%） ，基因片段 在 100320 bp，以 120200 bp 的基因 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 片段占优势地位；MAD20 等位基因型 175 份（96.69%） ，基因片段在 100280 bp，以 120180 bp 的等位基 因片段占优势地位；RO33 等位基因型 126 份（69.61%） ，基因片段在 140520 bp，以 140160 bp 的基因片 段占优势地位。由此可见，K1 和 MAD20 基因型虫株为比奥科岛的优势 虫株。从表可见，大多数患者为多基因 型虫株混合感染，混合感染率为 97.24%。 仅有 1.10% （2/181）的样本为单独 MAD20 基因型虫株感染，未发现单独 感染 K1 和 RO33 的等位基因型虫株的 样本。 2.2 PfMSP-2 基因分型结果 181 份的血佣裥耘奔不颊叩难 样中的 173 份用上述等位基因特异性 引物经巢式 PCR 扩增得到 PfMSP-2 基 因片段（表 2） ，属于单独 3D7 等位基 因型感染 48 份（26.52%） ， 片段长度 在 200330 bp，单独 FC27 等位基因型 感染 4 份（2.21%） ，基因片段长度在 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 330500 bp。可见 3D7 型虫株为该岛 优势虫株。其余 121 份血样同时扩增出 两种不同等位基因型的基因片段， 混 合感染率为 66.85 %。 3 讨论 某一地区恶性疟原虫种株的基因 分型及变异程度与患者的年龄、遗传特 性有一定的关系，也与疟疾疫苗的效果 评价密切相关4，因此，恶性疟原虫的 基因分型是近年来国际上的研究热点。 PfMSP-1 和 PfMSP-2 作为疟原虫裂殖子 表面蛋白家族中的两个重要成员，参与 疟原虫裂殖子入侵红细胞的过程， 同 时能诱导宿主产生免疫应答效应，因此， 对其进行分型研究具有重要意义。 本研究通过对中非地区赤道几内 亚共和国的比奥科岛恶性疟原虫的种群 进行 MSP-1 和 MSP-2 基因的分型研究， 结果表明比奥科岛恶性疟原虫种群分别 有 26 种 MSP-1 和 42 种 MSP-2 的等位 基因型存在。这明显高于其中非邻国的 报道，如 Aubouy 等10 报道的加蓬存 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 在 25 种 PfMSP-1 等位基因型和 19 种 PfMSP-2 等位基因型；Mayengue 等11报 道刚果存在 15 种 PfMSP-1 等位基因型 和 20 种 PfMSP-2 等位基因型； Dolmazon 等 12报道的中非共和国 （CAR）的 17 种 PfMSP-1 等位基因型 和 25 种 PfMSP-2 等位基因型。 比奥科岛的恶性疟原虫种群的 MSP-2 基因存在两种类型，即 3D7 等 位基因型和 FC27 等位基因型，它们分 别扩增出 22 和 20 种基因片段。与其他 中非邻国相比，3D7 等位基因型在加蓬 报道了 8 种10 ，刚果共和国的布拉柴 维尔发现了 10 种11 ，在中非的班基发 现了 11 种12 。FC27 等位基因分别在 加蓬10、刚果共和国的布拉柴维尔11 、 中非的班基12 发现了 11、10、11 种， 因此，赤道几内亚的 PfMSP-2 的多态性 明显高于其他的中非国家；本研究亦发 现比奥科岛恶性疟原虫种