斑贞1号、tmp和5―fu联合对人胃癌细胞ercc1表达的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 斑贞 1 号、TMP 和 5FU 联合对人 胃癌细胞 ERCC1 表达的影响 摘要 目的 探讨斑贞 1 号、川 芎嗪（TMP）和五氟尿嘧啶（5-FU）联 合逆转人胃癌细胞系 SGC-7901/ADR 与 ERCC1 表达的影响。 方法 采用半 定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） ， 监测人胃癌细胞 SGC-7901/ADR 细胞在 5-FU 组、斑贞 1 号组、斑贞 1 号+5-FU 组、斑贞 1 号+5-FU+TMP 组切除修复 交叉互补基因 1（ERCC1）mRNA 的表 达情况。 结果 5-FU 组与阴性对照组 比较，ERCC1 mRNA 表达差异无统计 学意义（P0.05） ，而 5-FU 联合中药斑 贞 1 号及 TMP 处理组 ERCC1mRNA 表 达量明显升高（P 中国论文网 /6/view- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 12828552.htm 关键词 胃癌；斑贞 1 号； TMP；5-FU ；多药耐药；ERCC1 基因 中图分类号 R735.2 文献标识 码 A 文章编号 1673-9701（2016）26- 0034-03 胃癌是中国常见的恶性肿瘤之一， 至今为止手术仍是胃癌的主要治疗方法， 因早癌诊断率低，70%患者失去手术机 会，所以化疗显得非常重要，但目前最 大的问题是胃癌多药耐药性（MDR） ， 近几年发现1，2ERCC1 参与胃癌的多 药耐药，并起重要作用，本课题组侯培 珍等3研究结果示斑贞 1 号、5-FU 和 TMP 联合对人胃癌有逆转作用。本课 题采用 RT-PCR 方法比较人胃癌细胞 （SGC-7901/ADR）经过不同药物组治 疗后的 ERCC1 mRNA 的表达量，进一 步探讨各药物组对人胃癌 SGC- 7901/ADR 细胞的作用机制。现报道如 下。 1 材料与方法 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 1.1 细胞系 胃癌 SGC-7901/ADR 细胞，第四 军医大赠。 1.2 药物、试剂及主要仪器 自拟“ 斑贞 1 号” 每毫升含露蜂房、 山茱萸、斑蝥、女贞子各 0.2 g。5- FU（规格：10 mL：0.25 g，国药准字 H31020593，上海旭东海普药业有限公 司） 、TMP（规格 40 mg，国药准字 H20031302，安徽制药） ，RPMI1640 培 养基（RPMI 为 Roswell Park Memorial Institute 缩写，1640 是培养基代号，其 中含有 10%胎牛血清，美国 GIBCO 北 京有限公司） ，二甲基亚砜、胰蛋白酶 （美国 Sigma 公司产品） ，新生小牛血 清（杭州四季青公司） ，两步法 RT-PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司产品） ，引物片段（上海生物工程公司） ， PCR 扩增仪（Ambion 公司） 、电泳仪 及紫外分光度计（北京六一公司） ， Trizol（TakaRa 公司） ，紫外透视成像系 统（上海精科实业有限公司） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 1.3 实验方法 1.3.1 细胞处理 取对数生长期的 细胞，以 5104/mL 浓度接种于 6 孔板 上，每孔用吸管加入 2 mL，然后培养 24 h，然后分为五组；对照组、5-FU 组、 斑贞 1 号组、斑贞 1 号+5-FU、斑贞 1 号+ 5-FU+TMP，分别加入等量的新的 培养液，5-FU 稀释液、斑贞 1 号稀释 液、斑贞 1 号+5-FU 稀释液、斑贞 1 号 +5-FU+TMP 稀释液。培养 48 h 后，经 过 PBS 缓冲液冲洗，提取总 mRNA。 1.3.2 RT-PCR 提取细胞中的总 RNA：以 mRNA 为模板，采用 Oligo 随 机引物，利用逆转录酶反转录成 cDNA。然后再以 cDNA 作为模板 PCR 扩增，琼脂糖电泳并拍照，分析电泳条 带灰度值，检查基因 mRNA 转录相对 量的变化。具体步骤如下：以 mRNA 为模板经逆转录合成 cDNA， 每个反 应体系 25 L，目的基因引物各 0.5 L，Takara Taq 1 L，10PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 L，dNTP -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 Mixture 2 L，ddH2O 13.5 L；各样品 cDNA 5 L，灭菌蒸馏水 13.5 L。经过 预变性变性退火延伸， （PCR 扩 增条件分别为 94 1 min，58 30 s，72 45 s，72 10 min） ，共 30 个 循环，最后延伸 72 10 min，扩增结 束，取 10 L 样品，跑电泳 60 min， （经 100 V 恒压， 2%琼脂糖）然 后采集电泳图像，得出各电泳带光密度 值， -action 引物正义列为 5- GTGGG GCGCAGGCACCA-3，反义 列为 5- CTCCTTAATACGCACGATTTC- 3ERCC1 基因引物序列的正义列引 5- TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3， 反义列引物为 5- ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3。 1.4 统计学方法 应用 SPSS17.0 统计学软件进行 数据分析，计量资料以均数标准差 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 （xs）表示，进行方差分析及 LSD-t 检验，P0.05） 。其他药物组与对照组相 比及组间比较均有统计学意义 （P0.05） ，见表 1。 2.2 ERCC1 和对照基因 -action 的 RT-PCR 产物经琼脂糖分离后电泳图 切除修复交叉互补基因 1（ERCC1）和对照基因（-action ）的 RT-PCR 产物经琼脂糖分离后分别位于 354bp 和 548bp，见图 1。 A、B、C 、D 、E 分别代表的是 阴性对照组（5-FU 组、斑贞 1 号组、 斑贞 1 号+5-FU 组、斑贞 1 号+5- FU+TMP 组）ERCC1 的表达， A1、B1、C1 、D1 、E1 分别代表的是阴 性对照组（5-FU 组、斑贞 1 号组、斑 贞 1 号+5-FU 组、斑贞 1 号+5-FU+TMP 组）-action 的表达 图 1 ERCC1 和对照基因 -action 的 RT-PCR 产物经琼脂糖分离后电泳图 3 讨论 目前我国胃癌发病率及死亡率位 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 居恶性肿瘤第三位4，化疗是胃癌治疗 中其重要作用，但大部分药物因多药耐 药（MDR）使化疗失败5。 近年研究发现 ERCC1 基因与恶 性肿瘤的多药耐药及肿瘤的发生、发展、 疗效预测及预后相关。此基因在许多肿 瘤组织中表达低下，对头颈部鳞癌的研 究发现，ERCC1 水平低表达可能是发 生头颈部癌的危险因素，在对食管癌和 胃食管结合部癌的研究中，发现 ERCC1 的表达降低与恶性肿瘤的发病 率增加有关，在胃癌的研究中也得到了 相似的结果。在胃癌的研究中发现6 ERCC1 的表达水平与化疗敏感性密切 相关，认为其表达水平对进展期胃癌患 者的临床疗效进行有效预测。马冬等7 回顾性分析发现 ERCC1 表达与淋巴结 转移相关而与肿瘤大小、浸润深度无关。 而胡锵、于东风等8研究却发现此基因 表达水平与患者性别、年龄、组织学类 型、淋巴结转移均无相关性。而李紫燕 等9研究发现此基因在胃癌组织中表达 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 水平与患者年龄、肿瘤部位、组织学类 型、分期及淋巴结转均无关，而与性别 有相关，赵国华、吴杰等10发现 ERCC1 阴性的胃癌患者采用 5-Fu 和奥 沙利铂化疗的疗效更好。李红等11研 究发现 ERCC1 在胃癌组织中的表达与 组织学分级及研究中，有无淋巴结转移 无明显差异，本课题组先前已证实胃癌 细胞对 5-FU 耐药性，ERCC1（切除修 复交叉互补基因）是 Westerveld 等在 1984 年发现的，此基因定位于人类第 19 号染色体短臂 13.213.3 位点上，大 小为 15 kb，ERCC1 基因拥有四种分子 量的 mRNA，但只有 1.1kb mRNA 具有 核苷酸切除修复作用。关于肿瘤发生和 发展的学说认为肿瘤是致癌相关的危险 因素暴露造成 DNA 损伤，再加上 DNA 修复基因表达低下造成基因损伤不断地 在上皮细胞内累积导致癌基因和抑癌基 因突变等一系列连续事件作用的结果。 ERCC1 基因表达低下影响细胞对 DNA 加合物及核苷酸损伤的修复，可导致 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 p53、K-RAS 基因突变增加，从而增加 恶性肿瘤的发生率12 。ERCC1 修复了 损伤的基因，使基因组保持完好，减少 了癌变相关基因的出现，使细胞能保持 正常的生物学活性，从而减少癌变的几 率，降低了肿瘤的发病率13，14。 斑贞 1 号合剂（斑蝥、露蜂房、 女贞子、山茱萸） ，斑蝥能抑制肿瘤细 胞 DNA 和 RNA 合成，杀伤肿瘤。它对 HeLa 细胞及人食管、胃、肝、乳腺癌 细胞均有抑制作用，能促进造血干细胞 分化，加速粒细胞的释放，很好地对抗 了放化疗中血细胞下降，减少了不良反 应。TMP 通过多