焦磷酸测序检测cyp2c19基因多态性方法的建立

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 焦磷酸测序检测 CYP2C19 基因多态 性方法的建立 摘要 目的 建立一种基于焦磷 酸测序技术的用于 CYP2C19 基因多态 性快速检测的方法。 方法 选择 2016 年 12 月2017 年 3 月于贵州省人民医 院行健康体检者 50 名，提取其基因组 DNA，针对 CYP2C19*2（ 681GA） 、 CYP2C19*3（636GA ） 、 CYP2C19*17（-806CT ）3 个单核苷酸 多态性（SNP ）位点分别设计一套 PCR 扩增引物和焦磷酸测序引物。将 PCR 扩增产物制备成单链测序模板，用 Qiagen PyroMark Q24 焦磷酸测序仪进 行测序和基因型分析，采用 Sanger 一代 测序技术对焦磷酸测序结果进行验证。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 结果 根据出峰的碱基和峰高可清楚判 断出 3 个 SNP 位点的不同基因型，检 测结果与 Sanger 测序结果完全一致。 50 名健康体检者中检出 CYP2C19 超快代 谢型 1 例，快代谢型 22 例，中代谢性 22 例，慢代谢型 5 例。 结论 本研究建 立的焦磷酸测序检测 CYP2C19 基因多 态性的方法具有快速、准确、成本低的 特点，适用于临床实验室对 CYP2C19 基因多态性的分型。 中国论文网 /6/view-12954881.htm 关键词 CYP2C19；基因多态性； 焦磷酸测序；氯吡格雷 中图分类号 R446.9 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 10（b）-0011-04 Establishment of genotyping methods for polymorphisms of CYP2C19 gene based on pyrosequencing technology YANG Nannan1 XU Qin1 LUO Zhenyuan2 FU Xue2 HUANG Shengwen2 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 1.School of Clinical Laboratory Science， Guizhou Medical University， Guizhou Province， Guiyang 550004， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Guizhou Provincial Peoples Hospital， Guizhou Province， Guiyang 550002， China Abstract Objective To establish a fast detection method for CYP2C19 genotyping based on pyrosequencing technology. Methods Genomic DNA was extracted from 50 blood samples of healthy subjects collected from December 2016 to March 2017 in Guizhou Provincial Peoples Hospital， and a set of amplification primers and pyrophosphate sequencing primers were designed according to the single nucleotide polymorphism （SNP ） sites of CYP2C19*2 （681GA） ， CYP2C19*3 （636GA） ， CYP2C19*17 （- 806CT）. Single-stranded templates -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 were made from PCR products， then sequencing and genotyping analysis were performed on a Qiagen PyroMark Q24 Sequencer System. The sequencing results were verified via Sanger sequencing. Results Based on the type and peak height of bases of DNA sequence， the genotypes of three SNPs could be identified clearly， which were consistent with Sanger sequencing results. Among the 50 samples of healthy group， 1 case was ultra-rapidmetabolism， 22 cases were rapidmetabolism， 22 cases were medium metabolism and 5 cases were slow metabolism. Conclusion The detection method of CYP2C19 polymorphism based on pyrosequencing technology is quick， accurate and convenient， which can be used to analyze the genotyping of CYP2C19 gene polymorphism. Key words CYP2C19； Gene -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 polymorphism； Pyrosequencing； Clopidogrel 氯吡格雷是R 床上常用的抗血 小板聚集的药物之一，冠状动脉介入术 （percutaneous coronary intervention，PCI ）后患者需长期服用 氯吡格雷来进行抗血小板治疗1-2，但 临床上部分患者会出现氯吡格雷抵抗3。 氯吡格雷的主要代谢酶为细胞色素 P4502C194-6，其编码基因 CYP2C19 的多态性是影响氯吡格雷疗效的主要遗 传因素7-8 。 CYP2C19 的等位基因以 CYP2C19*1（野生型） 、 CYP2C19*2、CYP2C19*3 和 CYP2C19*17 较常见9。超快代谢型的 基因型为*1/*17、*17*17，快代谢型的 基因型为*1/*1，中代谢型的基因型为 *1/*2、*1/*3，慢代谢型的基因型为 *2/*2、*3/*3 和*2/*310-11。本研究采 用焦磷酸测序技术建立了一种 CYP2C19 基因多态性检测方法，并用 Sanger 测序法对其准确性进行验证。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 1 对象与方法 1.1 对象 选择 2016 年 12 月2017 年 3 月 贵州省人民医院健康体检成人 50 名， 其中男 21 名，女 29 名，平均年龄为 （35.79.7）岁。 1.2 主要仪器与试剂 NP968 核酸自动提取仪（西安天 隆科技有限公司） ；美国 ABI Veriti96 PCR 仪（美国 ABI 生物系统公司） ； Qiagen PyroMark Q24 焦磷酸测序仪 （德国凯杰公司） ；PCRU 增引物和 焦磷酸测序引物（上海生工生物有限公 司） 。 1.3 方法 1.3.1 基因组 DNA 的提取 根据 天隆 NP968 核酸自动提取仪的说明书进 行全血 DNA 提取，对 DNA 样本进行 浓度和纯度检测，置于-20保存备用。 1.3.2 CYP2C19 多态性位点的引 物设计 在 NCBI 上分别下载 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 CYP2C19*2（681GA ） 、 CYP2C19*3（636GA ）和 CYP2C19*17（-806CT ）3 个单核苷酸 多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点上下游各 1 kb 范围的基因序列，采用 PyroMark Assay Design Software 2.0（德国凯杰公 司）软件设计 PCR 引物和焦磷酸测序 引物。见表 1。 1.3.3 PCR 扩增 25 L PCR 反应 体系包括：PyroMark PCR Master Mix 12.5 L，CoraLoad Concentrate 2.5 L，Q-Solution 5 L，25 mmol/L MgCl2 1.5 L，上下游 PCR 引物各 0.5 L，DNA 1 L，RNase-free water 1.5 L。PCR 反应条件：95预变性 15 min，94变性 30 s，CYP2C19*2 50、 CYP2C19*3 53、CYP2C19*17 49退 火 30 s，72C 延伸 30 s，共 45 个循环， 最后 72延伸 10 min。PCR 产物经过 2%的 琼脂糖凝胶电泳检测是否为所需的目的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 片段。 1.3.4 制备预混液以固定 PCR 产 物 80 L 反应体系包括 Beads 2 L，Binding buffer 40 L，PCR 产物 10 L，高纯水 28 L。 1.3.5 单链的分离 将 0.3 mol/L 测序引物分配到 q24 反应板的每个孔中。 打开开关，将真空工具放到 PCR 管的 孔中，持续 15 s，以捕获带有 PCR 产物 的 sepharose 珠。依次用 70%乙醇、变 性溶液、洗涤液冲洗真空工具 10 s，关 闭真空开关。将真空工具放到孔中，左 右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物。 1.3.6 测序引物与 DNA 链退火 将 q24 反应板置于 80加热块上加热样 本 2 min，样本冷却至室温（1525） 后即可放入焦磷酸测序仪内测序。 1.3.7 基因型分析 通过 Qiagen PyroMark Q24（德国凯杰公司）软件对 结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高 分别判断各位点的基因型。 1.3.8 Sanger 测序验证 将 3 个 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 SNP 位点的 PCR 产物送上海生工生物 有限公司采用 Sanger 测序法进行检测， 并与焦磷酸测序结果进行比对。 2 结果 2.1 PCR 结果 电泳结果显示，3 个 SNP 位点的 PCR 产物均在相应位置呈单一条带。见 图 1。 2.2 3 个 SNP 位点的基因型检测 结果 3 个 SNP 位点均可通过出峰的碱 基和峰高清楚判断出不同的基因型，信 噪比较高，非特异峰的比例均在 10%以 内。50 个样本中 3 个位点的基因型与 Sanger 测序结果完全一致。见图 24（左侧为焦磷酸测序检测结果，右 侧为 Sanger 测序结果） 。 2.3 50 名样本 CYP2C19 基因型 检测结果 根据 3 个 SNP 位点的检测结果， 可以得出每个样本的 CYP2C19 基因型， 并判断出其代谢类型。50 名健康体检者 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 中检出超快代谢型 1 例，快代谢型 22 例，中代谢性 22 例，慢代谢型 5 例。 见表 2。 CYP2C19 的 4 种等位基因频率 显示，野生型 CYP2C19*1 所占比例为 67.0%，其次是 CYP2C19*2，占 29.0%。见表 3。 3 讨论 检测 CYP2C19 多态性的方法除 了金标准 Sanger 测序技术外，常用的还 有限制性片段长度多态分析、飞行时间 质谱12、DNA 微阵列芯片、高分辨率 熔解曲线分析、Taqman 探针等技术13。 这些技术均具有较高的准确性，但操作 步骤较为繁琐，或是需要依赖昂贵的仪 器，检测成本较高，不适合规模的推广 应用。为适应临床对 CYP2C19 基因多 态性检测的需要，有必要建立一种高效、 快速、准确度高、灵敏度好、经济适用 的检测方法。 焦磷酸测序是一种基于 DNA 序 列分析的技术，是检测 SNP 最为准确 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 的方法之一14 。焦磷酸测序适用于对 已知短序列的测序分析，其敏感性和精 确性能与金标准（Sanger 测序法）相提 并论，并能够实时、直观、准确、定量 提供待测序列的信息15-17，已广泛用 于基因多态性检测、微生物分型、基因 甲基化检测等领域18 。 本研究建立的焦磷酸测序检测方 法可对 CYP2 C19 基因进行快速、准确 的分型，可在 20 min 内对 24 个标本进 行平行检测，检测结果与 Sanger 测序结 果完全一致，并且检测成本低于 Sanger 测序法。另外，由于人群中等位基因 CYP2C19*17 的频率较低，其他方法较 少对其进行检测