流式细胞分析在动物学研究中的应用

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 流式细胞分析在动物学研究中的应 用 摘要：指出了流式细胞分析 （Flow cytometry， FCM）是运用流式 细胞仪对液相中悬浮细胞或微粒进行研 究的新兴技术。目前已广泛应用于生物 学、医学等领域，它具有检测速度快、 灵敏度高，且操作简便等特点。介绍了 流式细胞仪的发展及其原理，阐述了流 式细胞分析在动物学研究中的应用，包 括在水生动物、哺乳动物以及动物病理 学研究等方面的应用，并对其进行了总 结与展望，为流式细胞分析的进一步发 展提供参考，以期流式细胞仪在动物学 研究中得到更好的发展。 中国论文网 /7/view-12990412.htm -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 关键词：流式细胞分析；流式细 胞仪；动物学 中图分类号：Q95 文献标识码：A 文章编号： 1674-9944（2017）14-0163-05 1 引言 流式细胞分析是利用流式细胞仪 对荧光分子标记的动植物细胞、细菌、 病毒以及其中的 DNA、RNA、各种蛋 白或其它分子进行研究，也可用于研究 塑料微球或其他悬浮于液体中的微粒， 是对液相中的细胞或微粒进行参数快速 分析和分选的技术1。流式细胞仪集激 光技术、电子物理技术、光电测量技术、 计算机技术以及细胞荧光化学技术、单 克隆抗体技术为一体2，灵敏度高、测 量速度快、被测群体大且能进行多参数 测量，即对同一个细胞做有关物理、生 物化学特性的多参数测量35。目前 已广泛运用于医学、生物学、材料学等 领域，特别是在医学及生物学领域得到 较快的发展。在生物学中，流式细胞仪 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 用于植物研究中较少，而在动物学中的 应用相对较多。 2 流式细胞仪的发展及原理 1934 年，Andrew Moldaran 开始 了流式细胞分析的第一步，他通过显微 镜技术，发明了一个能让细胞通过毛细 管，并能对细胞进行计数的仪器1。 1953 年，Parker 和 Hutcheon 描述一种 全血细胞计数器装置，成为了流式细胞 仪的雏形6。 1967 年，Kamentsky 和 Melamed 在此基础上设计了分选仪器， 它能给注射器提供电刺激，从液流中找 出目标细胞，再进行观察分析，这就是 流式分选的雏形1。1969 年，Marvin van Dilla 报道了第一台荧光检测的流式 细胞仪，它用氩离子激光作为光源，包 括照射、电子检测以及液流系统1。后 来，流式细胞仪朝着能检测和分选不同 类型细胞的大型机以及功能越来越强大、 系统稳定发展的小型机两个方向发展1。 流式细胞仪的原理：目前使用的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 流式细胞仪包括 4 个系统：液流系统、 光学检测系统、电子控制系统以及分析 系统1。具有分选功能的流式细胞仪还 具有分选系统7。其原理是进行荧光染 色的悬浮细胞或微粒在压力下，经鞘液 包绕形成鞘流，依次进入流式照射室的 检测点，氩离子激光照射细胞发出散射 光和荧光，其信号强弱与细胞内待测组 分含量成正比1，6 。散射光和荧光被 前向光电二极管和侧向 90方向的光电 倍增管接收放大后转化成电信号，再经 转换器形成数据文件，储存在计算机上， 以备脱机后的数据处理和分析7。 流式细胞仪的分选原理：具有分 选功能的流式细胞仪通过细胞分选器分 离含有单细胞的液滴完成细胞分选检测。 由喷嘴喷射出的液流柱经高频的压电晶 体产生高频振荡，嗔研纬删 匀的液 滴，根据选定的参数判明是否将被分选， 而后对选定的细胞液滴充上正或负电荷， 当带电液滴通过静电场发生偏转，后落 入收集器中，通过不同孔径的喷孔及液 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 流速度，实现细胞分选6，8。 3 流式细胞分析在动物学中的应 用 近年来，随着生物学研究的深入， 流式细胞分析作为一种重要辅助研究的 方法被广泛应用于生物学领域，特别是 动物学、细胞生物学等领域。 我国对流式细胞仪的研发起步较 晚。1981 年，北京师范大学生物系引进 了国内第一台流式细胞仪7。此后，流 式细胞分析不仅在科研领域，而且在临 床医学等领域得到了较快的发展。 流式细胞分析最早用于细胞的分 选以及血细胞的分类研究。1975 年， Gray9首次运用流式细胞仪观察用 DNA 荧光染料染色的中国仓鼠 （Cricetulus barabensis griseus）细胞中 的染色体，根据染色体上染色含量的不 同将单个染色体进行分拣。1984 年， De Laat 和 Blass10首次报道了运用流 式细胞分析识别和分拣植物染色体。国 内最早的流式细胞分析应用是许秀芹， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 王宜艳11等学者，其利用流式细胞分 析将海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎 等的血细胞分成透明细胞、小颗粒细胞 和大颗粒细胞 3 个亚群。 3.1 流式细胞分析在水生动物中 的应用 流式细胞分析早期应用于水生生 物的研究中。沙爱龙1在 Ashton- Alcox12与刘东武13等国内外学者应 用流式细胞分析将美洲牡蛎、中国蛤蜊 和紫石房蛤的血细胞分为 3 类的基础上， 利用流式细胞仪将短蛸的血细胞分为大 透明细胞、小透明细胞、小颗粒细胞和 大颗粒细胞 4 种类型，他的研究表明与 王晶14的活体染色方法相比，流式细 胞分析更为方便可行，研究结果也更为 精确。此外，沙爱龙1还概述了流式细 胞分析在水生无脊椎动物细胞免疫学、 染色体核型分析、无脊椎动物细胞核等 方面的应用，并提出随着流式细胞仪的 发展，它将会应用到无脊椎动物的生殖 与遗传研究中，推动其分子细胞水平的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 研究。高如承15 等就流式细胞分析在 水生动物细胞分类、分选、细胞免疫功 能、DNA 研究以及精子质量评价方面 进行了综述。流式细胞仪能快速、准确 地量化大量单细胞的形态和功能，能更 好地了解双壳类机体的免疫状况，从而 保证养殖业更好地发展。Michael 等在 单细胞水平上利用荧光标记及流式细胞 仪对美国东部的牡蛎防御机制进行了量 化，结果发现颗粒细胞的吞噬活性和呼 吸爆发活力最强，中间颗粒细胞次之， 透明细胞无活性15，16 。Helene Hegaret17等应用流式细胞分析对牡蛎 血细胞的凝集、吞噬作用、生存能力以 及呼吸爆发等功能在温度升高 （2028）前后进行研究，发现粒细 胞具有较高的免疫性，有可能在免疫防 御中起关键作用18 。 应用流式 细胞分析进行染色体核型分析是在 1975 年首次使用流式细胞仪的基础上逐渐发 展起来的，与传统核型分析相比，它操 作更为简单准确，且流式细胞分析还能 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 对染色体进行纯化，得到克隆实验所要 求的染色体，这是目前其他技术无法完 成的2。测定细胞 DNA 含量时，用 DNA 特异性荧光染料对细胞核进行染 色后，利用流式细胞仪进行检测，激光 激发后，荧光强度与细胞 DNA 含量成 正比，因此可得到被测细胞的 DNA 含 量，从而可进行染色体倍性鉴定，但必 须用已知 DNA 含量的细胞群体做参照 15，19。 流式细胞分析还可用于生物精子 质量评价，但其在水生生物精子评价中 利用较少20 ，21 。高如承15 综述了 国内外学者应用流式细胞分析评估水生 动物精子的质膜完整性及线粒体活性的 报道，但细胞凋亡方面未见报道，主要 报道是对其它细胞的凋亡研究，流式细 胞分析在此方面的应用多见于哺乳动物。 3.2 流式细胞分析在哺乳动物中 的应用 流式细胞仪目前已成为生物研究 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 中广为用之的仪器，它不仅能用于水生 生物的血细胞分类、分选、细胞免疫机 制、染色体核型分析等方面，而且在哺 乳动物研究中的运用更为广泛。 3.2.1 分离哺乳动物的精子 人为地对精子类型进行选择，产 生人类期望的性别后代，能促进畜牧业 的发展。哺乳动物（家畜）中，有两条 染色体，后代性别主要由父代的 X/Y 染 色体决定，通常 X 精子的 DNA 含量比 Y 精子多 3.0%4.5%22，23 。应用用 流式细胞分析对哺乳动物的精子进行分 离，可获得高纯度的 X/Y 精子群24， 且分离速度快、准确性高。其原理是根 据 DNA 含量的差异及所结合的荧光染 料激发的荧光强度差别分辨出 X、Y 精 子，利用流式细胞仪的分选原理，通过 产生振荡，将液流断裂形成含 X 或含 Y 精子的均匀液滴，然后充上正（X 精 子）或负电荷（Y 精子） ，经电场力的 引导落入不同的收集器中，即可分离精 子24， 25。 1989 年首次采用了流式细 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 胞分析分离了兔的 XY 精子，随后，这 一技术逐渐应用于猪、牛、羊的精子分 离26。高庆华 27运用流式细胞术初 步建立了山羊、梅花鹿和马鹿分选精液 的低剂量受精技术体系且进一步采用扣 除杂交筛选奶牛精液，初步获得牛 XY 精子间的差异表达基因。曲蕾22等综 述了流式细胞分析在哺乳动物精子分离 中的应用以及影响精子分离效率的因素， 她指出染色液及流式细胞仪在分离时对 精子活力有一定影响，所以应选择适当 浓度的染色液。马利兵26等提出了流 式细胞分析在分离哺乳动物的性别中的 注意事项，表明对分离后的精子采用自 然沉淀法进行浓缩可避免精子活力下降。 3.2.2 检测哺乳动物精液质量 通过精液质量检测测定精子的活 力，在临床不孕症治疗及家畜繁殖中具 有重要作用。利用流式细胞分析检测反 映精子活性的多个指标，例如精子质膜 完整性、顶体状态、染色质结构完整性 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 等，测定精子的生育能力，这种方法适 合自然状态下的精子检测，需结合荧光 显微镜，与传统方法相互验证使用，其 检测速度快，且便捷准确28。 3.2.3 流式细胞分析与细胞增殖、 凋亡 何旦莎30 等采用流式细胞仪对 经特异性荧光染料染色不同年龄的大鼠 脑组织的 DNA 进行含量的测定，结果 表明，不同年龄不同部位的脑组织增殖 程度不同，且同一部位的脑组织在不同 年龄阶段，增殖情况也存在差异。 也可利用流式细胞分析对 DNA 含量、线粒体膜、Ca2+浓度进行检测， 分析细胞凋亡情况30 。王磊31 等利 用流式细胞分析对正常大鼠红细胞、老 龄大鼠红细胞以及 2 型糖尿病大鼠红细 胞进行研究，对比生理和病理两种情况 对红细胞凋亡的影响，结果显示：糖尿 病大鼠大量红细胞存在凋亡，且血液黏 稠度增大，其他两类大鼠红细胞不存在 凋亡。因此，可以看出红细胞凋亡与年 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 龄无关，而与血液黏度有关。同样，也 可利用流式细胞分析显示 DNA 含量直 方图，分析细胞周期，但它只能分辨出 G0/G1 期、S 期、G2/M 期细胞 32。后 来，覃吉超33 等在 Cyclin 的时相性表 达理论34基础上建立了 Cyclin E+A/DNA 多参数 FCM，实现了将细胞 周期分为 6 个时期的细胞群体，尤其是 促进了 G1 期的进一步研究。 3.3 流式细胞仪在动物病理学研 究中的应用 3.3.1 在动物免疫疾病中的应用 对 CD 抗原的分析可以反映淋巴 细胞的分型和机体的免疫状态35。淋 巴细胞可分为 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、 NK 细胞等几类36，37 。根据 CD3、CD19 在 T、B 淋巴细胞上的作 用，以及 CD19 在 B 淋巴细胞分化为成 熟的浆细胞之后会丢失，可利用流式细 胞分析检测淋巴细胞表面的 CD3 和 CD19，从而计算淋巴组织中 T、B 细胞 的含量38。外周血 T 淋巴细胞亚群 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 （CD+4/CD+8）在机体正常情况下比值 是一定的，约 21，但是当机体细胞免 疫力低下时会出现比例下降25，35。 这可用于检测机体免疫疾病，例如，人 体被 HIV 感染后，大量 CD+4 细胞被破 坏，其比值小于 1。但是当自身免疫功 能亢奋时会引起如类风湿性关节炎等自 身免疫疾病35 。杨蕾芳39等利用流 式细胞仪检测小鼠感染附红细胞后，在 不同组不同时间段 CD4、IL-17 的表达 变化，探讨 Th17 细胞发挥的免疫学功 能。结果表明小鼠感染附红细胞后 Th17 细胞增多，因此推测 Th17 细胞可 能在附红细胞体感染过程中发挥了一定 的免疫调节。屈雪琪40 等利用流式细 胞仪检测不同方式处理以及不同保存时 间的猪淋巴细胞，探讨其对 T 淋巴细胞 亚群中 CD3+、CD4+、CD8+亚群的影 响。 3.3.2 流式细胞分析在巨噬细胞 功能检测中的作用 巨噬细胞具有吞噬、清除及呈递 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 抗原异物的生物学功能，属于免疫系统 的重要成员，是维持机体的正常生理状 态所必需的，其与许多重大疾病的发生 和发展密切相关。 1982 年，Steinkamp 首创荧光微 球流式细胞分析定量检测吞噬功能，目 前，流式细胞分析在单核巨噬细胞吞 噬功能研究中得到广泛应用。黄琼41 等利用流式细胞仪观察在不同处理温度、 不同孵育时间下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 荧光微球或荧光素标记大肠杆菌的能力， 结果表明，在一定范围内，随着温度及 孵育r 间的延长，吞噬百分率会增大。 流式细胞分析检测巨噬细胞吞噬能力较 传统方法更准确，且快速、高效，可应 用于评价保健食品对巨噬细胞吞噬功能 的影响41。金齐力等 42通过不同浓 度荧光素标记结核分枝杆菌以及不同孵 育时间的实验，建立流式细胞分析检测 单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝 杆菌的方法，表明该方法简便、快速且 重复性好。 3.3.3 流式细胞分析 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 在血小板聚集功能检测与临床医学中的 应用 2013 年，国外学者报道了一种基 于流式细胞分析检测血小板聚集率的新 方法43。在此基础上，梅金平44 等 用 CD61-PE 和 CD61-PITC 标记经 ADP、川芎嗪等处理后的小鼠血小板， 通过流式细胞仪检测两种荧光染料的细 胞群占所有血小板的百分比来评估血小 板的聚集功能。结果显示，不同处理对 小鼠血小板的影响不同。小鼠作为一种 模式生物，与人类亲源性较高，基于流 式细胞分析的小鼠血小板聚集活性检测 方法，在临床医学上对血小板相关的基 础研究以及抗血小板药物筛选平台具有 借鉴价值。 流式细胞仪在临床医学中最早应 用于肿瘤学中，通过对 DNA 含量变化 的测定，对癌变过程作出判断，这利于 癌前病变的有效措施，在以后的化疗过 程以及预后评估等工作中也能起到指导 作用45 47。流式细胞分析也可用于 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 16 检测人体器官移植后的排斥反应，通常 检测受体器官与供体器官二者血清中是 否有相