核酸的分离与纯化.pptx

1、核酸的分离与纯化,华西医院实验医学科 分子诊断室 王军,背景,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸提取也成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。 核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操作，直接关系到实验的成败与否，是临床分子诊断容易发生问题步骤。,核酸的存在形式,DNA：细胞核DNP 线粒体 环状DNA RNA：细胞质中，mRNA，rRNA，tRNA 通常与蛋白质结合，形成RNP,核酸的理化性质,DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。D

2、NA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。,核酸提取方法,核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。 核酸提取时应遵循以下原则: 1、保证核酸分子一级结构的完整性; 2、排除其他分子污染。,核酸提取方法,大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括：

3、 细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。,核酸提取方法细胞裂解,细胞裂解可通过以下几种方法实现： 物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）,核酸提取方法细胞裂解,物理作用： 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。 超声裂解法提取的核酸片段长度从 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般 10kb。,核酸提取方法细胞裂解,化学作用： 变性： 加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20

4、、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 碱性PH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、STE 等) 在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。,核酸提取方法细胞裂解,酶作用（生物作用）： 主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。 蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质

5、,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。,核酸提取方法酶处理,在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。 如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase)； 或者加入DNase 或RNase 去除不需要的DNA或RNA。,核

6、酸提取方法分离与纯化,酚氯仿法 简介：1976，Stafford及其同事创立。现已经不断改进。 关键技术： 酚的使用 用酚来分离核酸首先是Kirty，1956年首次报道。当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机相。,核酸提取方法分离与纯化,酚氯仿法,核酸提取方法分离与纯化,酚氯仿法 酚的准备 重蒸酚(去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联的醌类氧化物）； 加入8一羟基喹咛，以防止酚氧化，（酚氧化发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联）； 水饱和酚、平衡PH（大于7.8）（不饱和的酚能与15%其提及的水互溶，从而降

7、低水相中核酸产量） 发展和改进： SDS取代阴离子盐 酚：氯仿混合液（增加了对糖、脂的溶解） 异戊醇的使用（减少泡沫、使RNase失活）,核酸提取方法分离与纯化,酚氯仿法 裂解缓冲液（异硫氰酸胍）处理 蛋白酶K消化，（根据需要亦可加入Dnase或RNAase） 50:48:2苯酚:氯仿:异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。 转移水相，重复步骤3，直至满意为止。 核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05. 5 ,终浓度为0.

8、 3M 的NaAc 或KAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入23倍体积的预冷的无水乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。 14000g离心30分钟室温，或者如果产量较大可直接用玻璃钩子取出。 70%乙醇洗涤2-3次，即可将沉淀溶于TE保存。,核酸提取方法分离与纯化,酚氯仿法 纯度高，RNA回收效率极高，尤其是200bp的RNA，比如：siRNA，miRNA，mRNA和tRNA等 除核酸外，可提取蛋白质 耗时，繁琐，不利于自动化。 正式名称：异硫氰酸胍-酚-氯仿核酸提取法 By Piotr Chomczynski and Nicoletta

9、 Sacchi 1987,核酸提取方法分离与纯化,盐析法-miller 1、细胞裂解同前述； 2、加入2体积的6mol/L的NaCl，与3体积的细胞裂解液混合，震荡混匀，2500rmp离心1520min，此时DNP溶解于上清中，蛋白质、RNA等位于离心管底部； 3、小心转移上清，同前步骤用乙醇沉淀法进一步纯化。,核酸提取方法分离与纯化,盐析法-NaAC 1、细胞裂解同前述；并加入蛋白酶K消化 2、加入1/10体积的3mol/L的NaAC，与1体积的细胞裂解液混合，震荡混匀，-20孵育 15 min；台式离心机最大速度离心1520min； 3、小心转移上清，同前步骤用乙醇沉淀法进一步纯化。,核酸

10、提取方法分离与纯化,盐析法 产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害； 同样不适合大规模自动化提取。 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。,核酸提取方法分离与纯化,硅胶吸附法 1、细胞裂解和酶处理同前述； 2、处理好的裂解液转入硅胶离心柱，高速离心，利用硅胶可以吸附核酸而不能与其它物质如蛋白质，脂类等结合的特点，洗脱这类杂质； 3、重复洗涤，提高纯度，最后用核酸洗脱液获得核酸。,裂解液；洗涤液；洗脱液装入位置,硅胶层,液体流出管道,核酸提取方法分离与纯化,硅胶吸附法 产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。,核酸提取方法

11、分离与纯化,磁性硅胶吸附法 1、细胞裂解和酶处理同前述； 2、处理好的裂解液与磁性硅胶颗粒混匀，孵育约30分钟，使裂解液中的核酸物质与硅胶粘附； 3、利用磁力架固定吸附了核酸的硅胶颗粒；吸尽管中的液体，加入洗涤液重复本次步骤2次。 4、洗脱液收获核酸。,核酸提取方法分离与纯化,磁性硅胶吸附法 产量较好，纯度很好； 成本较低，无特殊耗材； 可通过设计特异探针附着于硅胶颗粒，从而可捕获特异物种的核酸成分； 可实现自动化作业。,核酸提取方法分离与纯化,加热煮沸法 1、高速离心富集含核酸物质； 2、加入促细胞裂解的化学物质（SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB

12、、sar-cosyl 、Chelex-100 ）等；加入蛋白酶K消化一段时间，也可不加，直接95以上加热10分钟左右； 3、高速离心，上清中的DNA即可用于PCR扩增。,核酸提取方法分离与纯化,加热煮沸法 只能用于DNA提取；一般仅用于血清或体液中病原体DNA的提取； 成本最低，临床应用最广； 纯度低，产量低；除了PCR外不能直接用于其它分子生物学操作； 纯手工操作，临床PCR工作中最易出问题的环节。,核酸提取方法分离与纯化,RNA提取应该注意的问题： 无处不在的RNase，比较耐高温，不易失活； 解决的办法： 1、用于分离RNA的耗材，如有可能必须采用高压灭菌； 2、用于分离RNA的试剂尽量

13、采用DEPC水配制，（DEPC是RNase的强烈抑制剂） 3、操作人员务必佩戴一次性乳胶手套操作RNA的提取。 4、RNA提取体系中两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和-巯基乙醇 5、低温离心,核酸提取方法分离与纯化,其它核酸分离纯化的方法： 1、玻棒缠绕法；玻璃粉（珠）吸附法； 2、甲酰胺解聚法； 3、离子交换层析；亲和层析法； 4、密度梯度离心法； 5、等等,核酸提取方法分离与纯化,分离纯化方法小结：,实验室常见样本核酸提取方法,血清样本核酸提取方法： 血清中可能存在的核酸及其来源： DNA：HBV，HCMV，EBV等； RNA：HCV，HIV等 胞外游离核酸（循环核酸） 游离

14、DNA 在血清中以双链形式存在，多数可与核蛋白形成复合物，通过琼脂糖电泳观察DNA 呈“梯形”分布，片段大小约在180 21000 bp之间。 一般需要0.2-1ml的血清进行核酸提取。,实验室常见样本核酸提取方法,血清样本核酸提取方法： 血清中微生物来源DNA提取方法： 1、 加热煮沸法； A、 高速离心富集病原体颗粒； B、弃上清，加入表面活性剂等，95-10010分钟； C、高速离心，DNA游离于上清，蛋白质等杂质位于管底。 纯度极差，但成本很低，手工操作重复性在临床可接受范围。 2、磁珠法； 成本较高,实验室常见样本核酸提取方法,血清样本核酸提取方法： 血清中微生物来源RNA提取方法：

15、 1、 酚氯仿法； 繁琐，手工操作重复性较差 2、磁珠法； 方便，易于自动化，重复性很好，成本较高,实验室常见样本核酸提取方法,血清样本核酸提取方法： 血清中循环核酸提取方法： 1、酚氯仿法； 2、磁珠法； 人类基因组、发生肿瘤时异常升高；-孕妇的循环核酸亦可来源于胎儿。,实验室常见样本核酸提取方法,全血样本核酸提取方法： 1、 酚氯仿法； 纯度好，产量较高，完整性高 2、磁珠法； 纯度好，产量较高，完整性较高 3、 硅胶柱吸附法； 纯度好，产量较低，完整性一般 4、加热煮沸法 纯度差，产量较低，完整性差 前处理：红细胞裂解液or低渗液去除红细胞 应用于：融合基因检测，遗传病检测等,实验室常见

16、样本核酸提取方法,痰标本提取方法： 清晨深部痰，无唾液，无口腔微生物污染； 痰液中大量粘蛋白，需液化后进行提取操作。 加热煮沸法；磁珠法；层吸柱等均可。 常用的痰标本液化方法： 1、3-5倍体积1M NaOH，消化30分钟左右。过程中可加热。 高速离心后，提取沉淀核酸。 2、蛋白酶消化过夜，直接处理全部液体。 3、Saccomno液+DTT,实验室常见样本核酸提取方法,痰标本提取方法： Saccomno液：每50毫升固定液中含50 乙醇48 mL，2聚乙二醇1 mL、0.3利福平1 mL ； DTT (二硫苏糖醇)液: 0.1g DTT、0.78g NaCl、0.02g KCl、0.112g

17、磷酸二氢钠、0.02g 磷酸二氢钾，加水至2L，使DTT浓度为0.005； 上述两种液体等体积混合，12倍体积加入到痰液中，振摇液化30min，高速离心，沉淀提取核酸。 Saccomanno法是1963年由Saccomanno建立的一种经典的痰液固定方法，其主要作用是固定痰液中脱落细胞的形态，使细胞膜不致于破裂，防止细胞崩解，以利于进行脱落细胞学检查。DTT法由桥木等人首先应用，破坏粘液蛋白中的二硫键，对痰液的液化效果较好，单独使用DTT可能导致痰液从溶液向凝胶状态转化。Saccomanno固定液能稳定分子间的关系，从而避免痰液凝胶状态化，达到很好的液化效果。,实验室常见样本核酸提取方法,尿液

18、标本提取方法： 一般采用晨尿检测；尿液中的核酸主要为病原体（NG，CT，UU，BK-JC，TB等）少量人类基因组核酸。 无特殊前处理。 一般留取30-50ml尿液，高速离心，用沉淀进行核酸提取。沉淀可用PBS或生理盐水进行2-3洗涤。 加热煮沸法；磁珠法；层吸柱等均可。,实验室常见样本核酸提取方法,脑脊液标本提取方法： 肉眼观察，清亮的脑脊液样本，无特殊前处理；浑浊样本因其含有较多炎性细胞或其它粘性细胞，则需用前述痰标本液化方法处理。 脑脊液中的核酸主要来源为病原体，如结核杆菌等 一般至少用0.2ml脑脊液进行核酸提取。 加热煮沸法；磁珠法；层吸柱等均可。,实验室常见样本核酸提取方法,胸腹水标

19、本提取方法： 肉眼观察，清亮的胸腹水样本，无特殊前处理；浑浊样本因其含有较多炎性细胞或其它粘性细胞，则需用前述痰标本液化方法处理。 胸腹水中的核酸主要来源为病原体，如结核杆菌等 一般至少用15ml左右样本进行核酸提取。 加热煮沸法；磁珠法；层吸柱等均可。,实验室常见样本核酸提取方法,组织切片提取方法： 组织切片中的核酸主要为人类局部病灶基因组，如癌组织基因组。目前实验室主要用于检测Kras和EGFR突变。 一般前处理方法： 1、切除多余石蜡； 2、将组织切碎，是最大径不超过0.5mm； 3、加入细胞裂解缓冲液，继续捣碎呈匀浆； 4、加入蛋白酶和SDS等，70振荡孵育过夜； 5、酚氯仿，磁珠，层

20、析柱等分离纯化核酸。不推荐加热煮沸，因其纯度过低。,实验室常见样本核酸提取方法,血痕，毛发，口腔拭子标本提取方法： 法医物证常见样本。 血痕：约0.5cm大小，浸泡于红细胞裂解液约30分钟，高速离心弃上清，加入0.2ml 10%chelx100和适量蛋白酶K，56孵育约1小时，加热煮沸，高速离心获得DNA； 毛发：将毛囊部分浸入0.2ml 10%chelx100和适量蛋白酶K液体中， 56孵育2小时以上，加热煮沸，高速离心获得DNA； 口腔拭子：口腔拭子浸入生理盐水orPBS中，挤压洗涤数分钟。余同血痕DNA提取。,实验室常见样本核酸提取方法,前列腺液，精液，宫颈分泌物等标本提取方法： 发生生

21、殖道感染时，从该类样本中提取相关病原体核酸。 比如：NG，CT，UU，HPV等 精液需进行液化，一般37放置30min即可自行液化，如有病理情况，参照痰液样本进行液化。 前列腺同脑脊液等；宫颈分泌物多为拭子，同口腔拭子。 实验室多用加热煮沸法进行DNA分离纯化。,实验室常见样本核酸提取方法,结核杆菌提取方法：,实验室常见样本核酸提取方法,结核杆菌提取方法：,细胞壁富含脂质。一般的溶菌酶没有破壁效果。,实验室常见样本核酸提取方法,结核杆菌提取方法： 常用的破壁方法： 1、超声破壁； 2、匀浆器破壁； 3、液氮研磨； 4、氯仿:乙醇（2:1）脱脂破壁； 5、碱裂解煮沸法等 6、市售专用TB裂解液，Qiagen、bioMrieux、Invitrogen等 结核杆菌可来源于各种样本：痰、脑脊液、尿、胸腹水、组织切片等,实验室常见样本核酸提取方法,琼脂糖电泳回收DNA方法：,用途：获得特异的PCR和/或提取的核酸片段,实验室常见样本核酸提取方法,琼脂糖电泳回收DNA方法： 1、切胶，TE或蒸馏水浸泡过夜； 2、切胶后采用前述核酸分离纯化方法或市售试剂盒。,实验室核酸提取