《蛋白质的化学》PPT课件.ppt

1、第一节 蛋白质的生物学意义,第二节 蛋白质的元素组成,第三节 蛋白质的氨基酸组成,第四节 肽,第五节 蛋白质的结构,第六节 蛋白质分子结构与功能的关系,第七节 蛋白质的性质,第八节 蛋白质的分类,第一章 蛋白质化学,Protein,内容提要,蛋白质是细胞中除水之外含量最丰富的分子。生物体蛋白质种类极其繁多，而其各自具有独特的结构和功能，在细胞结构、生物催化、物质运输、运动、防御、调控及信息识别等方面起极其重要的作用，几乎参与生物体所有的生命活动。 蛋白质的基本结构单位是氨基酸，氨基酸之间通过肽键连接成多肽链，蛋白质就是由一条或多条多肽链构成的生物大分子。蛋白质的结构可以分为六个层次来研究，即一

2、级、二级、超二级、结构域、三级、四级结构。一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。而二级及以上结构又称为高级结构或构象。 各种蛋白质的生物学功能都由其特定构象决定，当蛋白质遭到破坏时它的生物学功能随之丧失。而蛋白质分子的构象往往由其一级结构决定。,蛋白质 是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。,蛋白质的定义,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,一、蛋白质的生物学意义,1. 生物体的组成成分（结构蛋白，如：指甲、头发）,2. 催化功能

3、酶（几乎都是蛋白质）,3. 运输功能（如：血红蛋白）,4. 运动功能（如：肌肉收缩）,5. 防御功能（如：抗体、干扰素）,6. 遗传信息的控制（如：受体蛋白）,7. 细胞膜的通透性,8. 高等动物的记忆、识别机构,蛋白质的生物学意义,二、蛋白质的元素组成,蛋白质是一类含氮有机化合物，通过元素分析，发现其元素组成与糖、脂质不同，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、钼、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 04 其他 微量（磷、铁、钼、碘、锌和铜等）,蛋白质的含氮量及蛋白质系数,氮占生物组织中所

4、有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。又由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%（即每100克蛋白质中含有16克氮元素），这是蛋白质元素组成的一个特点，也是实验室利用凯氏定N法测定蛋白质含量的计算基础。这样就可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量。 蛋白质系数（1克氮所代表的蛋白质质量(克数)，即16%的倒数6.25）。,蛋白质含量 = 蛋白氮 6.25 粗蛋白含量 = 生物样品含氮量 6.25,定氮法测定蛋白质含量,凯氏定N法就是利用此原理来测蛋白含量的，它是至今测定蛋白质含量的最准确的方法。（安排实验） 练习题： 5g物质测出N为0.2g，求Pr

5、的含量。 0.26.251.25（g） 1.25/5 25,氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。 目前从各种生物体中发现的氨基酸已有250多种，但参与蛋白质组成的氨基酸（基本氨基酸或标准氨基酸）只有20种；此外在某些蛋白质中还存在若干种不常见的氨基酸，大多数已发现的天然氨基酸是不参与蛋白质组成的，这些被称为非蛋白质氨基酸，大多数非蛋白质氨基酸的生物学作用不详。 20种基本氨基酸，除脯氨酸外，结构上的共同点是于羧基相连的-碳原子上的氢原子被氨基所取代，因而均为-氨基酸）。 各种蛋白所含的氨基酸的种类和数目都各不相同。,三、蛋白质的氨基酸组成,除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。,各种氨基酸的

6、区别在于侧链R基的不同。20种基本氨基酸按R的极性可分为非极性氨基酸、极性性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。（掌握氨基酸分类表！）,-氨基酸,可变部分,不变部分,3.1 氨基酸的结构通式,3.1 20种标准氨基酸,氨基酸的结构(甘氨酸),甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构(丙氨酸),脂肪族氨基酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,氨基酸的结构(缬氨酸),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构(亮氨酸),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸

7、,氨基酸的结构(异亮氨酸),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine,脂肪族氨基酸,氨基酸的结构(脯氨酸),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline,亚氨基酸,氨基酸的结构(甲硫氨酸),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline 甲硫氨酸 Methionine,含硫氨基酸,氨基酸的结构(半胱氨酸),甘氨酸 Gly

8、cine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline 甲硫氨酸 Methionine 半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,氨基酸的结构(苯丙氨酸),芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine,氨基酸的结构(酪氨酸),芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine,氨基酸的结构(色氨酸),芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trytophan,氨基酸的结构(精氨酸),碱性氨基酸,精氨酸 Arginine,氨基酸的结构(赖氨酸),

9、碱性氨基酸,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine,氨基酸的结构(组氨酸),碱性氨基酸,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine 组氨酸 Histidine,氨基酸的结构(天冬氨酸),天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,氨基酸的结构(谷氨酸),天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,氨基酸的结构(丝氨酸),丝氨酸 Serine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构(苏氨酸),丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构(天冬酰氨),天冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,氨基酸的结构(谷氨酰氨),天冬酰胺 Aspar

10、agine 谷氨酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,根据R的化学结构 （1）脂肪族氨基酸： 1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys； 2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr （2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr （3）杂环氨基酸：Trp、His （4）杂环亚氨基酸：Pro,根据R的极性 （1）极性氨基酸： 1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys； 2）带正电：His、Lys、Arg； 3）带负电：Asp、Glu （2）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,3.2

11、氨基酸的分类,记忆法： 甘丙丝半苏缬蛋，亮和异亮中性完。 酸性谷氨天门冬，精赖氨酸属于碱。 芳香族有酪苯丙，组色氨酸归杂环。 脯氨酸属亚氨酸，还有天冬谷酰胺（中性）。 含羟基的氨基酸有：Ser Thr 含硫的氨基酸有：Cys Met,必需aa： 1、 定义：人体或动物体不能合成，只能 由食物提供的氨基酸叫必需aa。 人8种，动物10种。 2、包括： 苏缬亮异亮，苯丙属芳香。 还有色赖蛋，缺一人遭殃。 动物需十种，精组且莫忘。 也可：一家写两三本书来！ （异甲缬亮色苯苏赖）,3.3 几种重要的不常见氨基酸(了解）,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。 这些氨基酸都

12、是由相应的基本氨基酸衍生而来的。,3.4 氨基酸的重要性质,氨基酸一般物理性质（了解） 氨基酸的旋光性(了解) 氨基酸的光谱性质（了解） 氨基酸的两性解离(掌握) 氨基酸的等电点(掌握),从结构通式可看出：除甘氨酸外，氨基酸均含有一个不对称的手性-碳原子，因此都具有旋光性。有的左旋有的右旋，比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。另外每一种氨基酸都有D-型和L-型两种立体异构体，取决于-碳原子上氨基的位置。 说明:旋光性和构型二者没有直接对应关系 从蛋白水解的到的-氨基酸（除甘氨酸外）都属于L-型。,3.4.1 氨基酸的旋光性,3.4.2 氨基酸的光谱性质,参与蛋白质组

13、成的20种氨基酸的在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区（200nm）都有光吸收，在近紫外区（200400nm）只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力（酪氨酸275nm、苯丙氨酸257nm、色氨酸280nm），蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处，因此实验室中可以利用分光光度法测定样品中蛋白质的含量。,3.4.3 氨基酸的两性解离性质（重要）,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是解离成两性离子。 两性离子：（兼性离子）是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO-负离子。 在两性离子

14、中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以解离状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,PH 1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子（向阴极移动） 两性离子 负离子（向阳极移动） （ 等电点PI）,3.4.4 氨基酸的等电点,定义：当调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的-NH3+基和-COO- 基的解离度完全相等时，即氨基酸所带的净电荷为零，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时氨基酸所处溶液的pH值即为该氨基酸的等电点，以符号pI表示。 在等电点时，氨基酸处于两性离子状态。 由于静电作用，在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀，不同的氨基酸

15、有不同的等电点，据此性质可分离制备氨基酸。 氨基酸的等电点除用酸碱滴定方法测定外，还可由其分子上解离基团的解离常数（PK值）来计算确定。,P计算： 方法：先写出解离方程，然后取两性离子两边的PK值的算术平均值，即可计算出P。（公式导出参阅课本） 侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2。（P8 例：Ala） 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 （P9 例：Asp ） 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-

16、NH2 )/2 （P9 例：Lys ）,酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 = 2.98 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 = 9.74,3.6 氨基酸的化学性质,1、氨基酸与茚三酮的反应 2、氨基酸与甲醛的反应 3、氨基酸与亚硝酸反应 4、氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应（Sanger反应） 5、氨基酸生成西佛碱的反应 6、氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应（Edman反应） 7、氨基酸与荧光胺反应 8、氨基酸与5,5-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应 9、氨基酸侧链R基团参加的反应,aa的化学性质对于学好蛋白质化学的重要性

17、,首先可用于鉴定和分析蛋白质水解产物中的氨基酸 进行Pr的氨基酸序列分析 Pr功能需要特殊的氨基酸的R基团 化学修饰改变Pr的功能性质 多肽人工合成,3.6.1 与茚三酮反应（安排实验）,用途：常用于氨基酸的定性（蓝紫色物质）或定量（在570nm波长下测光吸收值）分析。定量释放的CO2可用测压法测量并计算。 说明：两个亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与与茚三酮反应产生黄色物质，最大光吸收在440nm。,3-氨基和-羧基共同参加的反应,水合茚三酮,茚三酮,3.6.2 与甲醛发生羟甲基化反应,1-氨基参与的反应,用途：可以用来直接测定氨基酸的浓度。,3.6.3 与亚硝酸反应,注意：释放出的氮气（N2）N2

18、一半来自氨基酸,1-氨基参与的反应,用途：范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应。,说明：1、此反应为-氨基参与的反应 2、这个反应首先被英国的Sanger来鉴定多肽、蛋白质N末端氨基酸,3.6.4 氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应 (-氨基参与的反应),弱碱性溶液,DNP-氨基酸,说明：1、此反应为-氨基参与的反应 2、丹磺酰氯反应取代Sanger反应来测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高（荧光）,丹磺酰氯法测定蛋白质N端氨基酸,3.6.5 生成西佛碱的反应(了解),1-氨基参与的反应,用途：是多种酶促反应的中间过程。,pH8.3,无水HF,这个反应首先于1950年被Edman用于鉴定多肽

19、和蛋白质的N端氨基酸。 重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，后来设计出“多肽顺序自动分析仪” 此反应为-氨基参与的反应,3.6.6 氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,在室温下，氨基酸与荧光胺反应产生荧光产物 根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。,3.6.7 氨基酸与荧光胺反应,硫代硝基苯甲酸,测定Cys含量（pH8.0412nm的摩尔消光系数=13600） 此为R侧链上的SH参加的反应,3.6.8 氨基酸与5,5-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应,3.6.9 其他氨基酸侧链R基团参加的反应 酪氨酸的酚基可以与重氮化合物结合生成橘黄色的化合物（Pauly反应），用于检测酪氨酸； 组氨酸的侧

20、链咪唑基与重氮苯磺酸产生棕红色的化合物。,一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物称肽。 氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。,当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基。每一端都可以连接更多的氨基酸，氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（20个氨基酸残基以下）和多肽（多于20个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的-氨基和-羧基。,肽链写法：游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。,H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH,Ser-Leu-Phe,（S-L-F）,四、肽,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧

21、基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由三个氨基酸组成的肽称为三肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽，也叫多肽链。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。肽的概念包括了aa的组成及顺序。,4.1 多肽的结构,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始(通常为左端），以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,4.2 肽键(1)

22、（P19）,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。,4.2 肽键(2),肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，其中H和O原子处于C-N键的两侧形成反式结构。,由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonance structure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面上。,氨基的H与羰基的O几乎总是呈反式（trans）而不是顺式（cis）。与C-N相连的N-C和C-C键都可以旋转，平面间以C隔开。,蛋白质构象稳

23、定的原因：1）主链1/3是肽键；2）R的影响。,4.3 肽平面,肽平面,4.4 四肽的结构,4.5 天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,谷光甘肽（GSH）,存在于动植物和微生物细胞中的一个重要的三肽，简称GSH，是谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的。它的分子中有一个特殊的-肽键，是由谷氨酸的-羧基与半胱氨酸的-氨基缩合而成的。这与蛋白质分子中的肽键不同。 功能：某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要

24、是作用。,谷光甘肽（GSH）,催产素和升压素,均为9肽，仅第3位和第8位氨基酸不同，但功能差异明显，催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，用于引产，减少产后出血和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿，用于治疗尿崩症和肺咯血。,39肽，活性部位为第410位的7肽片段： Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。,脑肽,脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。,（甲）Met-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met （亮）Leu-脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。,促肾上腺皮质激素（ACTH

25、）与脑肽,促肾上腺皮质激素（ACTH）,胆囊收缩素,胰高血糖素,由胰脏-细胞分泌（-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高血糖素调节 维持血糖浓度。,其他肽类物质,肽类的生成（略）,通过基因编码合成大分子蛋白质的前体，然后水解，释放出有活性的肽。（只有天然aa） 通过合成酶直接合成。（含有非天然aa）,蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质的结构层次：一级结构primary），二级结构（secondary），超二级结构、结构域、三级结构（tertiary）和四级结构（

26、quaternary）（不总是有）。,五、 蛋白质的结构,5.1 蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构概念：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序（序列）就是蛋白质的一级结构。又叫初级结构、共价结构、化学结构。内容主要包括aa组成、连接方式、排列顺序。构成一级结构的键是共价键。 氨基酸残基的概念： （教材） 书写方式：,蛋白质的一级结构(Primary structure),包括组成蛋白质的多肽链数目. 多肽链的氨基酸顺序， 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,Pr一般由1001000aa组成，若随机排列，再加上有可能是链状、分枝状、环

27、状等，几乎是天文数字。而自然界中现已发现的Pr在105-6左右。 来源不同、功能相同的蛋白质很可能有相似的一级结构。如：胰蛋白酶、糜蛋白酶。 某些Pr一级结构发生细微变化，就能引起生物功能的显著变化，甚至使有机体出现病态现象。如：镰刀型红细胞贫血症，由于血红蛋白链第6位的aa改变引起。 正常：V-H-L-T-P-E-E-K 贫血：V-H-L-T-P-V-E-K,蛋白质的一级结构举例1、胰岛素一级结构,是胰脏中胰岛细胞分泌的一种相对质量较小的激素蛋白，由两条肽链共五十一个氨基酸组成，一条叫A链(21)，一条叫B链(30)。 分子量为5734道尔顿。,2、核糖核酸酶一级结构,是测出一级结构的第一个

28、酶分子，由一条含124个残基的多肽链组成，分子内有4个链内二硫键。,3、血红蛋白一级结构,血红蛋白分子是一个四聚体，两条相同的 链(141个)和两条相同的链(146个)。,5.2 蛋白质一级结构的测定（掌握课本内容）,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有约10万个不同蛋白质的一级结构被测定。 蛋白质一级结构确定的原则 蛋白质一级结构测定的原则及实例,蛋白质一级结构测序的策略,（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 （2）拆分蛋白质分子的多肽链 如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分。 （3）断开多肽

29、链内的二硫桥 多肽链内半胱氨酸残基之间的S一S桥必须在进行第4步前予以断裂。 （4）分析每一多肽链的氨基酸组成 经分离、纯化的多肽链，一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。 （5）鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基 多肽链的另一部分样品进行末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。,一级结构测序的策略,（6）裂解多肽链成较小的片段 用两种或几种不同的断裂方法（指断裂点不一样）将每条多肽链样品街解成两套或几套重叠的肽段或称肽碎片。每套肽段进行分离、纯化，并对每一纯化了的肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。 （7）测定各肽段的氨基酸序列

30、目前最常用的肽段测序方法是Edman降解法，井有自动序列分析仪可供利用。此外尚有酶解法和质谱法等。 （8）重建完整多肽链的一级结构 利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠可以拼凑出原来的完整多肽链的氨基酸序列。 （9）确定半脱氨酸残基间形成的S一S交联桥的位置。,5.3 测定步骤,(1)多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,5.4 测定步骤,(1)多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定

31、,5.4 测定步骤,(2)测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,5.4 测定步骤,(3)二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,5.4 测定步骤,可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,1,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,(

32、4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,5.4 测定步骤,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。,蛋白质一级结构的测定,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端基氨基酸测定,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定, 二硝基氟苯（DNFB）法,在碱

33、性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端基氨基酸测定, 丹磺酰氯法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端基氨基酸测定, 肼解法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残

34、基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定,氨肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶法,5.4 测定步骤,(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或

35、肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定, 酶解法: 胰蛋白酶， 糜蛋白酶， 胃蛋白酶， 嗜热菌蛋白酶， 羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,几种重要的蛋白水解酶的专一性, 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,5.4 测定步骤,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,5.4 测定步骤,(8)确定肽段在多肽链中

36、的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 例：P18,蛋白质一级结构的测定,5.4 测定步骤,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析， 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,例：N-末端残基H C-末端残基S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO借助重叠肽确定肽段次序,末端残基 H S 末端肽段 HOW

37、T APS 或OUS 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全序列 HOWTOUSEOVERLAPS,蛋白质的空间结构,构型:指在一个化合物分子中，原子的空间排列，这种排列的改变会涉及到共价键的生成与破坏。（如：L-aa和D-aa这两种异构体如果没有共价键的破坏是不能互变的） 构象： 指一个化合物分子中的一切原子，由于单键的旋转而形成的不同的空间排列，这种空间排列的改变不涉及共价键的破裂。 蛋白质的构象（三维结构、空间结构、立体结构、高级结构）：蛋白质的空间结构通常称为蛋白质的构象，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排

38、列分布和肽链的走向。,5.5 蛋白质的二级结构,蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 主要有-螺旋、-折叠、-转角及自由回转。,（1）-螺旋（ -角蛋白螺旋图） -helix,Pauling和Corey于1951年提出,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;每个残基绕轴旋转100。 -螺旋中氨基酸残基侧链伸向外侧，相临的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与轴平行。 天然蛋白

39、质分子大多数为右手-螺旋。,（1）-螺旋结构要点,稳定因素：链内氢键的形成 影响因素：可否形成氢键、电荷、R基大小,（2）-折叠（ 图）,丝心蛋白(fibroin) 具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。,（2）-折叠,Pauling等提出。 如：卷发(烫发)的生物化学基础 角蛋白在湿热条件（破坏氢键）下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。 角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。 还原剂含疏基的化合物，另外还有氧化剂,-pleated sheet,-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链

40、间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象 在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直。 -折叠有两种类型。一种为平行式，另一种为反平行式（氢键与链的长轴接近垂直，更为稳定） 。,（2）-折叠,为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状（ -转角）。它是由第一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。,-转角经常出现在连接反平行-折叠片的端头。,（）-转角（-turn）,（）-转角（-turn）(图),（4）自由回转（无规则卷曲、自由绕曲）,是指没有一定规律的松散肽链结构,5.6.1 超二级结构是指若干相邻的二级结构

41、中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。,5.6 超二级结构和结构域,5.6.2结构域 是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球状的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。,5.7 蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。 维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子

42、键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。 例：肌红蛋白 （P25）,5.7 蛋白质的三级结构(图),5.8 蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。 这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，它一般由一条肽链构成，无生理活性或活力很小； 维持亚基之间的次级键主要是盐键和氢键。 由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；,四级结构的结构模型,两个亚基的结构,共价键,次级键,化学键,

43、肽键,一级结构,氢键,二硫键,二、三、四级结构,疏水键,盐键,范德华力,三、四级结构,5.9 蛋白质分子中的共价键与次级键,化学键,化学键：化学上把分子或晶体内相临原子（或离子）间强烈的相互吸引作用称为化学键。 化学键可大致分为电价键（主要形式为离子键）、共价键（或称原子键）和金属键三种。 键能一般就是指气体分子每断裂单位物质的量的某键时的焓变。键能越大，键越牢固。 键长：分子内成键两原子核间的平衡距离称为键长。两个确定的原子之间，键长越短，键能就越大，如： C -C C=C (键长短） 键角：在分子中两个相临的化学键之间的夹角称键角。 共价键：指原子之间由于成键电子的原子轨道重叠而形成的化学

44、键。共价键具方向性和饱和性。 共价键是否有极性，决定于相临两原子间共用电子对是否偏移；成键的两元素电负性差值越大，键的极性越强； 分子是否有极性，决定于整个分子中正、负电荷中心是否重叠。 离子键：其本质是阴阳离子之间的静电引力。无方向性和饱和性,氢键,分子间或分子内的某些基团之间可能形成氢键。 氢键：以FH为例，在HF分子中，由于F的电负性（4.0)很大，共用电子对强烈偏向F原子一边，而H原子核外只有一个电子，其电子云向F原子偏移的结果，使得其几乎要呈质子状态。这个半径很小、无内层电子的带部分正电荷的氢原子，使附近另一个HF分子中含有孤电子对并带部分负电荷的F原子有可能充分靠近它，从而产生静电

45、吸引作用，这种静电吸引作用力就是所谓的氢键。 氢键结合通式：XHY表示。式中X和Y代表F、O、N等电负性大而原子半径较小的非金属原子。X和Y 可以是同种元素、也可不同。 氢键的键能比共价键小得多，接近分子间力。,范德华力,分子间较弱的相互吸引作用，称为范德华力（引力）。 范德华力实际上包括引力和斥力两种相互作用。 范德华力（引力）：只有当两个非键合的原子处于一定距离时才能达到最大，这个距离称为范德华距离。 虽然就其个别来说范德华力很弱，但其数量大且具有加和效应和位相效应（当分子或基团相同时，其瞬时偶极矩同位相，从而产生最大的相互作用），因此不容忽视。,疏水键（疏水作用、熵效应）,水介质中球状蛋

46、白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象被称为疏水作用。 疏水作用并不是疏水基团之间有吸引力，而是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。 蛋白质溶液系统的熵增加是疏水作用的主要动力；熵增加主要涉及介质水的有序度改变，因为疏水基团的聚集（相互作用）本身是有序化的过程，造成熵减少。 当疏水基团进入水时，它周围的水分子将排列成刚性的有序结构（笼形结构），与此相反的过程（疏水作用）排列有序的水分子（笼形结构）将被破坏，这部分水分子被排如自由水中，这样水的混乱度增加，即熵增加，因此疏水作用是熵驱动的自发过程。 尿素和盐酸胍即能破坏氢键，又能破坏疏水作用，是强变性剂。,盐键,盐键又

47、称盐桥或离子键，它是正负电荷之间的一种静电引力。 在生理PH下，Pr中aa的侧链可发生相应的解离，在多数情况下，这些基团都分布在分子表面，而与介质水分子发生电荷-偶极之间的相互作用，形成排列有序的水化层，对稳定Pr构象有一定作用。 荷电的侧链也在Pr分子内部出现，一般与其他基团形成强的氢键，偶尔也有少数带相反电荷的侧链在分子的疏水内部相成盐键。,蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,1. 种属差异,蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的

48、远近。 同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。（如：各种脊椎动物中的血红蛋白） 同源蛋白质的aa序列中有不变残基、可变残基 同源蛋白的aa序列与提取他们的物种的亲缘关系具有同一性。,六、蛋白质分子结构与功能的关系,2.分子病 是指蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。（如：镰刀型贫血病）,从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。,-链 1 2 3 4 5 6 7 Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys,Val 取代Glu,含氧-HbA,O2,O2,粘

49、性疏水斑点,含氧HbS,血红蛋白分子凝集,镰状细胞贫血（sick-cell anemia）,别构现象：有些蛋白质表现其生物功能时，其构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象就称为别构现象。 别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用称为别（变）构作用。因别（变）构而产生的效应称别（变）构效应。,蛋白质构象与功能的关系,血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基的相互作用。（附：Hb和Mb氧结合曲线比较图）,煤气中毒的机制,一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200

50、倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。,7.1 蛋白质的相对分子量,蛋白质相对分子量一般在1万100万之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：一般把单位（cm）离心场里的沉降速度称沉降系数。,v =沉降速度（dx/dt） =离心机转子角速度（弧度/s） x =

51、蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s） 蛋白质的相对分子量可直接用沉降系数表示。,七、蛋白质的性质,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系(了解）,7.2 蛋白质的两性电离及等电点,Pr可解离基团有肽链末端-氨基和-羧基还有侧链基团。 Pr在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值的环境中，使蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即总静电荷为零，在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。 Pr在等电点，最不稳定，易借静电引力

52、聚集，沉淀析出，可用于分离、提纯。,电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 蛋白质电泳的方向、速度主要决定于其所带电荷的正负性，所带电荷的多少以及分子颗粒的大小。 电泳法可用于分离分析蛋白质混合物或作为蛋白质纯度鉴定的手段。 电泳法分类：自由界面电泳、区带电泳、凝胶电泳、圆盘电泳、平板电泳。 例：人血清Pr组分分析_纸电泳法（P32）,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,通电,等电聚焦电泳,蛋白质溶液是一种分散系统,水为介质,分散相质点为分子颗粒.颗粒直径在1-100nm(100nm为真溶液;100nm为悬浊液;介于1-100nm的为胶体溶液),因此具胶体性质:布郎

53、运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力。利用蛋白质不能透过半透膜的性质用羊皮纸等来分离纯化蛋白质的方法称透析法。,蛋白质溶液稳定的原因：1）Pr颗粒大：Pr分子大小恰好适于形成胶体，使它能在介质中作不断的布郎运动；2）带有电荷：在非PI的PH条件下，由于Pr颗粒表面带有相同电荷,使分子间有一定斥力，能保持一定距离，而不致凝集沉淀；3）形成水化膜：由于Pr分子表面分布许多带电基团与极性基团，它们对水有高度亲和力，在水溶液中会把水分子吸附在分子的表面形成一层较厚的水化膜，由于水化膜的存在使Pr分子间互相隔离，颗粒不会凝聚下沉。,7.3 蛋白质的胶体性质,1. 盐析法：向Pr溶液加

54、大量高浓度中性盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）破坏周围的水膜，又中和Pr分子的电荷，使蛋白质聚集沉淀。一般不引起Pr变性，除去盐可溶解。,分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 不同Pr所需中性盐浓度不同，可用此分离Pr。 盐溶：低浓度盐可以增加Pr的溶解度的现象,2. 有机溶剂沉淀法：有机溶剂（酒精、丙酮等）与水作用，破坏水膜，使Pr沉淀。PI与有机溶剂法配合效果更好，用于Pr分离纯化。注意：条件要温和，不然造成构象破坏而失活。,7.4 蛋白质的沉淀反应,蛋白质的沉淀反应,3. 重金属盐沉淀法：当溶液的PHPI时，Pr颗粒带负电荷，它容易与重金属盐（氯化高汞、硝酸银、醋酸铅等）中的重金属离子（Hg2+、 Ag+ 、Pb2+）结合成不溶性盐而沉淀。（如：误服重金属盐的病人可口服大量的牛奶或豆浆或生蛋清，然后在服用倾吐剂），此法能使Pr变性。 4. 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、能沉淀生物碱，称为生物碱试剂以及某些酸（如：三氯乙酸、水杨酸和硝酸） 当PHPI时，Pr颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和某些酸类的酸根负离子生成不溶性盐而沉淀。Pr变性（临床检验应用） 5.加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而