七种观察方式

1、显微观察方式,奥林巴斯光学北京办事处齐冬,观察方式,1.明场观察 2.暗场观察(暗视野) 3.相差观察(相衬观察) 4.偏光观察 5. DIC观察(微分干涉) 6. RC观察(浮雕相衬) 7.荧光观察,(一)明场观察方式,常规观察方式 应用领域： 常规镜检、病理、染色标本 优点： 视野亮度高、均匀， 应用范围广， 操作简单，价格低， 物镜适用于荧光观察 缺点： 透明标本对比度低， 标本没有立体感,明场观察显微镜的调节,瞳距调节 屈光度调节 光路转换 聚光镜中心 孔径光栏设置,瞳距调节,刻度指示,屈光度调节,调节,屈光度调节指示,光路转换,100%,80%,20%,100%,聚光镜中心调节, 光

2、轴中心调节螺钉, 视场光阑, 孔径光阑,10X物镜, 标本, 聚光镜升降旋钮,孔径光栏调节,N.A聚=(0.6-0.8)N.A物,孔径光栏开度与图象,100%,70%,30%,HR LC,HC LR,MR MC,(二)暗视野观察方式,1 原理 丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。 2 特点 观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 0.004 um (明场0.24um)”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高（灰尘、盖片、载片）,4 应用：微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察等,(二)暗视野观察方式,（三）相

3、差观察方式,1 原理 利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差,共轭面：吸收光线，直射光通过,补偿面：相位推迟，衍射光通过,物镜相板,聚光镜环状光阑,(三)相差观察方式,2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(210um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜,(三)相差观察方式,4 应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞),(三)相差观察方式,5 调节： 苛勒照明调节 将相差物镜及附件转入光路（物镜聚光镜相衬环型号匹配） 对

4、样品聚焦 取下目镜，装上CT望远镜， 调节CT焦距看到清晰的相差环 调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合,（四）偏光观察方式,1 原理 依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜,自然光（多振动面）,偏振器1,偏振器2,偏振光（单一振动面）,各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等 各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等,（四）偏光观察方式,应用：矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经

5、纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等,（五）微分干涉（DIC）观察方法,（五）微分干涉观察方法,1 原理 通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。,（五）微分干涉观察方法,2 特点 可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观 无须特殊物镜，与荧光观察配合更好 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。,（五）微分干涉观察方法,3 缺点 需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂,4 应用：无色透明活体标本的细微结构

6、，无色荧光标本，染色标本，显微操作等,（五）微分干涉观察方法,（六）浮雕相衬显微镜,（六）浮雕相衬显微镜,1 原理 斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。,2. 历史 1975年，Robert Hoffman 博士发明 2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品 3. 特点 提高未染色标本的可见性和对比度； 图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕； 可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ； 可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织； 聚光镜的工作距离可以设计的更长； R

7、C物镜也可用于明场,暗场和荧光观察,（六）浮雕相衬显微镜,4. 缺点 观察效果与标本方向密切相关 操作较复杂 必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜 观察荧光效果不如明场物镜 5. 应用 所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作,（六）浮雕相衬显微镜,荧光观察方法,什么是荧光 ?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发光化荧光,荧光的种类自发（固有）荧光 二次荧光,荧光显微镜的作用原理,宽谱线发射光（

8、汞灯）,滤掉其他光，透过激发光,激发滤色片,吸收滤色片,滤掉激发光，透过荧光,标本受激发产生荧光向四周发散,激发光受反射、折射或衍射向四周发散,荧光的性质,吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光显微镜的优点和用途,优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析,荧光显微镜的种类 透射式,荧光显微镜的种类落射式,荧光显微镜的主要部件,透射式 吸

9、收滤色镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯光源,落射式 吸收滤色镜 分光镜 激发滤色镜 汞灯光源,落射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,激发滤色镜,落射荧光显微镜的构造,荧光显微镜光源,汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G),氙灯光源： 高峰值更宽，更稳定,荧光显微镜激发透镜组,激发滤色镜: 激发波长选择,激发透镜组 （激发块）:,T%,nm,BAND PASS,入射光,发射光,激发 滤色镜,分光 滤色镜,吸收 滤色镜,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜: 荧光透过,阻挡杂光,分色镜: 反射激发光,荧光透过,A 透过,A,A 反射,B,B 透过,B 阻挡,nm,nm,T%,T%,A,落射荧光

10、显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜: 荧光透过,阻挡杂光,分色镜: 反射激发光,荧光透过,A 透过,A,A 反射,B,B ，C 透过,nm,nm,T%,T%,A,C,滤色镜的选择,荧光素的特性,滤色镜的特性,激发,分色,吸收,带宽对图象的影响,SWB: BP420-480,WB: BP450-480,WIB: BP460-490,NB: BP470-490,FITC+PI,多重染色标本的多色观察,FITC+Texas Red+DAPI,三色滤色镜的特性曲线,激发,分色,吸收,双重染色标本的单色和双色观察,WU,WIB,DUAL BAND,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,单色滤色镜的特性曲线,双色滤色镜的特性曲线,现行显微镜特点和各种滤色镜,自由组合 激发块,吸收滤色镜,激发滤色镜,分色镜,油镜应使用荧光油,物镜光栏的运用,光栏全开启,光栏适当关小,减少杂散光干扰,荧光的衰减,防衰减的方法 使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素 降低激发光强度 降低标本中氧的浓度,有衰减的标本,使用抗衰减剂的效果,汞灯灯箱构造,灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮,汞灯中心调节方法,放置荧光调中板或一张白纸于载物台上 转入B或G激发滤色镜 用10X物镜观察并聚焦 取下10X物镜 通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸 通过汞