第二章基因工程final.ppt

1、参考书： 1。基因工程孙明高等教育出版社2。基因工程原理吴乃虎科学出版社3。分子克隆实验指南，桑巴奇，伊夫弗里斯，马涅蒂斯，金东延等。科学出版社4。英国基因操作原则5。屈、顾红亚译基因操纵原理。高等教育出版社，原则：通过基因重组，目标基因可以在受体细胞中高效稳定地表达。操作水平：基因分子水平结果：生物体的遗传性状被定向修饰以获得所需的品种。在本文中，我们利用体外重组或聚合酶链反应扩增技术从某一生物基因组中分离出感兴趣的基因，或者通过人工合成获得该基因，然后通过一系列切割、加工和修饰形成重组的脱氧核糖核酸分子，然后将其转移到合适的受体细胞中(转化)，以获得基因表达的过程。什么是基因工程？基因工程

2、经常与下列名称混合，基因工程；基因克隆；分子克隆；基因操作；克隆):一种重组脱氧核糖核酸技术，是指含有某一目标脱氧核糖核酸片段的重组脱氧核糖核酸分子，或当用作名词时含有该重组分子的无性克隆。作为动词，它指的是基因分离和重组的过程。基因工程(例如，将细胞外产生的供体或核酸(物质)分子插入到病毒、质粒或其他载体系统中，形成能够持续繁殖的新生物，然后将其整合到最初不含此类物质的宿主受体中，基因工程的诞生和发展在20世纪70年代，保罗贝格和他的同事第一个创造了重组DNA分子，保罗贝格在基因工程中诞生和发展。1973年，美国的赫伯特博伊尔教授和斯坦利科恩教授在人类历史上首次进行了有目的的基因重组尝试，并

3、提出了“基因克隆”的策略。1975年获基因工程诞生和发展博士学位，发现分子克隆工具酶，通过限制性内切酶切割和产生特殊DNA片段的能力使纯化这些DNA片段成为可能，基因工程的诞生和发展，1978年，重组胰岛素，1979年，人类生长激素，基因工程的诞生和发展，1981年中国科学家克隆的第一个转基因动物，金鲤。加拿大第一生物技术公司成立于1995年。今天，生物技术已经对农业、医药、食品和许多其他产品产生了巨大的影响。基因工程的诞生和发展，什么是基因？编码具有特定功能的产品(如蛋白质或核糖核酸)的遗传信息的基本单位是染色体或基因组的脱氧核糖核酸序列。包括编码序列(外显子)、编码区前后具有基因表达调控功

4、能的序列以及单个编码序列之间的间隔序列(内含子)。脱氧核糖核酸外显子1内含子1外显子2外显子3内含子3外显子4，转录，前基因，基因，剪接，翻译，蛋白质，真核生物蛋白质合成过程中外显子和内含子之间的关系，生物进化的分子基础基因，使用入和使用出，获得性遗传，达尔文进化，拉马克进化，过度繁殖，生存竞争的遗传和变异，适者生存， 基因工程的优势打破了传统育种中难以突破的物种界限，可以在原核生物和真核生物、动物和植物以及人类和其他生物之间重组和传递遗传信息。为什么我们可以将一种生物的基因“移植”到另一种生物身上？这种嫁接是如何实现的？基因具有相同的物质基础，基因是可切割的基因，可转移多肽和基因之间存在对应

5、关系。一般基因可以复制和遗传，基因工程研究的理论基础，腺嘌呤(a)胸腺嘧啶(t)胞嘧啶(c)鸟嘌呤(G)，(1)获得靶基因；(2)与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；(3)利用重组脱氧核糖核酸分子转化受体细胞，受体细胞可以在受体细胞中复制和遗传；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养具有外源基因的细胞或生物体，以获得所需的遗传性状或表达所需的产物。重组DNA操作的一般步骤，基因工程操作的工具，限制性内切酶，从受体细胞中提取靶基因片段，需要基因的剪刀限制性内切酶。为了将目的基因与质粒连接起来，需要基因的针连接酶。为了将目标基因转移到大肠杆菌中，有必要转移该基因。限制性内切核酸酶，限制性内切核酸酶

6、定义为一种内部脱氧核糖核酸酶，它能识别双链DNA中的特殊核苷酸序列，并在每条链中断裂一个磷酸二酯键。型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶，不同的限制性内切酶可以特异性识别不同的特定核苷酸序列，限制性内切酶的名称，型限制性内切酶的特性，以及某些限制性内切酶识别序列中所包含的另一种限制性内切酶。例如，Sau3A识别：GATC BamH识别：GGATCC，一些限制性内切酶识别不同的核苷酸序列。例如，Hind识别四个核苷酸序列：5-CTPyPuAC-3 (Py嘧啶碱基c或t；嘌呤碱基a或g)，限制性酶：BamH，重复序列，结构相同，方向相反，正读和反读都相同。旋转对称或左右互补对称结构。为了书写

7、方便，识别序列可以表达为具有5-3个方向的单链DNA。型限制性酶的识别序列一般有回文，(a) 5p单链延伸粘端，(b)3OH单链延伸粘端，粘端(粘端)，各种限制性酶的切割类型多样，切割后形成各种粘端或平端；限制性内切酶的切割类型有，平端(平端)，限制性内切酶的切割类型有多种，切割后形成各种粘端或平端；切割型限制性内切酶，被同一限制性内切酶切割的几个脱氧核糖核酸有相同的粘性末端吗？尽管一些限制性内切酶具有不同的来源并识别不同的靶序列，但是它们切割DNA并产生相同的粘性末端。这种限制性酶被特别称为异考达姆。这两个相同的粘性末端被称为不相容末端。来自不同来源的一些限制酶识别相同的核苷酸靶序列，这些酶

8、被称为等通道酶。同分解酶的切割点的位置可以相同或不同。来自不同来源的一些限制性酶识别相同的核苷酸靶序列，这些酶被特别地称为同源酶。同分解酶的切割点的位置可以相同或不同。单酶消化和双酶消化的部分消化、DNA分子的断裂、天然DNA或化学合成的DNA经常需要被切割成可与重组连接的DNA片段，即DNA分子的断裂。1.具有互补粘性末端的片段的连接。两端扁平的脱氧核糖核酸片段之间的连接。修饰后DNA片段的连接4。添加杆后连接DNA片段。脱氧核糖核酸连接酶只能催化互补的粘性末端之间的连接，而脱氧核糖核酸连接酶可以催化双链脱氧核糖核酸片段的3-羟基末端和5-磷末端之间磷酸二酯键的形成，从而连接末端。催化互补粘

9、性端和平端之间的连接，但是平端之间的连接效率相对较低。具有互补粘性末端片段的连接，具有互补粘性末端和平末端片段的连接。DNA片段在末端修饰后被连接起来。外切核酸外切酶：在核酸水解酶中，它是酶的修饰，具有从分子链末端依次水解磷酸二酯键生成单核苷酸的功能。脱氧核糖核酸片段在末端添加后连接，经核酸外切酶修饰，并被酶消化。从甲生物细胞中取出的基因应该在乙生物体内表达。能将外源基因送入细胞的工具是载体。1.条件：2 .物种，质粒，噬菌体，病毒，不同的脱氧核糖核酸片段组合载体，载体-基因克隆载体。质粒是一种可以自主复制的双链环状DNA分子，质粒克隆载体，大肠杆菌质粒载体，可以克隆10kb以下的片段。细菌人

10、工染色体克隆载体，一般10kb、其他类型的载体包括：PCR克隆载体、噬菌体克隆载体、细菌克隆载体、病毒克隆载体、穿梭克隆载体、细菌人工染色体、细菌表达载体、真核表达载体、昆虫细胞载体、酵母表达载体、体外表达载体、荧光蛋白载体、双杂交载体、信号转导载体、siRNA表达载体、热休克载体、报道基因载体、亚细胞定位载体、转座子构建载体、噬菌体展示载体、载体类型、基因操作的基本步骤、获得靶基因以形成重组DNA分子和将重组DNA分子导入筛选含有靶基因的受体细胞。目标基因的表达，从供体细胞中提取所需基因，取出脱氧核糖核酸，用限制性内切酶切断脱氧核糖核酸。目前，广泛使用的靶基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素

11、基因、人干扰素基因等。提取目的基因的方法包括以下步骤：1 .直接分离基因，提取并分离细胞中的总DNA，将双链DNA加热至90-95，变性并拧松，成为单链DNA，成为互补链聚合反应的模板，冷却至37-60，结合模板复性，加热至70-75，用DNA聚合酶催化引物延伸5-3，合成模板DNA链的互补链，n个循环，达到2n拷贝2。通过聚合酶链反应扩增目标基因，聚合酶链反应原理，2。通过聚合酶链反应扩增靶基因，1。我们必须知道要扩增的目标基因片段的核苷酸序列。待扩增片段两端长度约为20bp的序列是已知的。允许扩增的DNA片段长度一般在1kb以内。扩增长度为几千个碱基的未知序列或大基因，有30多种特殊类型的

12、聚合酶链反应策略5、逆转录聚合酶链反应、免疫聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、实时荧光聚合酶链反应、原位聚合酶链反应等。过去，当你想扩增脱氧核糖核酸时，你总是有培养大量细胞的重要任务。这时，一个名叫凯利穆利斯博士的家伙走了出来，说体外合成是可以的！只需将模板与缓冲液混合，并加入一些引物核苷和聚合酶。变性、退火和延伸。加热冷却加热是惊人的！当你想检测突变，来吧，做聚合酶链反应！当你想要基因重组，来吧，做聚合酶链反应！当你想解决一个大案子，来吧，做聚合酶链反应！当你想知道父亲是哪个混蛋的时候，来吧，做聚合酶链反应！科学家寻求更好的聚合酶链反应，3由生物雷达公司推出，3。人工基因合成法，直接合成法：在

13、已知某一基因序列的前提下，可以通过化学方法合成或通过聚合酶链反应技术扩增获得目标基因。(如胰岛素基因)反转录方法：利用信使核糖核酸为模板，在反转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成为脱氧核糖核酸(基因)。根据蛋白质的氨基酸序列，计算信使核糖核酸的核苷酸序列，进而计算基因脱氧核苷酸序列。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。、DNA合成仪、聚合酶链反应扩增仪、目标基因化学合成全片段酶连接示意图、目标基因与载体结合形成重组DNA、提取质粒并用限制性内切酶切割、用限制性内切酶将目标基因与质粒连接、用限制性内切酶切割目标基因并用相同限制性内切酶切割质粒形成切口，将目标基因插入切口，目标基因的粘性端与切口的粘性端

14、互补配对后，在DNA连接酶的作用下，它们连接形成重组DNA分子。基因工程中常用的受体细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和动植物细胞。如果使用质粒作为载体，作为受体细胞的大肠杆菌的靶基因可以与受体细胞一起快速繁殖，并且可以在短时间内获得大量的基因。将靶基因导入受体细胞、扩增受体细胞、将重组DNA导入和扩增受体细胞、将重组DNA导入和扩增受体细胞、扩增和转化受体细胞：外源裸DNA进入受体细胞并在受体细胞中稳定维持和表达的过程称为转化。转染：如果外源基因分子是病毒或噬菌体或逆转录病毒，那么这个过程也称为转染。复合诱导转化：感受态细胞的电穿孔转化：超声波处理转化高压脉冲产生的瞬时通道：脂质体介导的转

15、化，通过破坏细胞膜形成膜通道：磷酸钙转染法DNA包被磷双层：动物细胞捕获DNA-磷酸钙沉淀，转化法常用于筛选含有靶基因的受体细胞。前三步非常复杂。为了确保靶基因的有效利用，通常使用大量的受体细胞来接收少量的靶基因。通过这种方式，很少有经过处理的受体细胞真的摄取了目标基因，这是必须检测的。无论受体细胞是否具有由载体特有的“标记基因”控制的特性，检测基础如下：1 .根据载体抗性基因和相应的药物筛选转化子；2.根据报道基因筛选转化子；3.根据噬菌斑筛选转化体；重组体的鉴定；1.根据重组DNA的分子特征进行鉴定。根据重组DNA分子大小鉴定聚合酶链反应扩增片段通过DNA杂交进行鉴定：Southern杂交、斑点杂交、菌落(噬菌体)原位