化学蛋白质组学

1、第五节化学蛋白质组学、人类基因组计划的顺利实施，生命科学研究的中心逐渐转移到了对生物功能的整体研究上。对生物功能的主要实施者或执行者蛋白质的表达模式和功能模式的研究必然成为生命科学的发展趋势。20世纪90年代中期，研究细胞内各种蛋白质组成和活动规律的新兴学科proteomics在国际上正在萌芽。蛋白质组(proteome)这个概念是澳大利亚学者1995年首次提出的，是蛋白质和基因组(genome)一词的复合体，指基因组中一个细胞组织或生物体在特定时间和空间表达的所有蛋白质。对蛋白质组学问题的研究称为蛋白质组学，主要对细胞内蛋白质的组成和活动规律进行整体研究。化学再次与生物学的最新发展相融合，形

2、成新的交叉研究领域化学蛋白质组学。化学蛋白质组学是目前不断扩大的新领域，学界还没有确切的定义。在一定程度上，化学蛋白质组学可以理解为化学加蛋白质组学。特别是，大部分蛋白质的功能直接依赖于小分子配体和靶蛋白的结合阶段，因此可以利用能与靶蛋白起特殊作用的化学小分子扰乱和检测蛋白质组，与以往蛋白质定性定量鉴定为基础的蛋白质组学技术不同，被认为是有希望的下一代功能性蛋白质组学技术(function-based proteomics)。第一，化学蛋白质组学研究方法，蛋白质组学对系统内蛋白质进行整体研究，常见的三种研究模式：第一种是检测蛋白质组学合理化参数的“完整蛋白质组学”。二是差异蛋白质组学，主要通过

3、比较分析徐璐不同状态的蛋白质表达图，实现对体系内代斯调节的动态监控，更容易揭示机体对内外环境变化反应的本质规律。第三主要是蛋白质功能模型研究，包括蛋白质的功能和蛋白质之间的相互作用。化学蛋白质组学的主要任务是开发和应用生物活性靶标探针，用于复杂蛋白质组中特定酶或蛋白质组的功能研究。小分子与细胞内靶蛋白的相互作用是许多蛋白质生物学功能的基础。这种相互作用是强弱不同的，可以反转，也不能反转。可以是单个靶，也可以同时作用于多个靶蛋白。生物体(细胞组织等)蛋白质组中的所有蛋白质都可以通过化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示(proteome profiling)来研究这种相互作用。以化学学科为例，通过

4、功能性蛋白质组学研究，为人类健康提供服务，促进分子医学的发展，如寻找先导药物及药物的靶分子，是重要的目标。(a)蛋白质组学的基本技术过程，目前，蛋白质组学研究一般有三个阶段：首先，利用双向电泳技术从样品中分离蛋白质。第二，应用光谱技术鉴定二维电泳分离的蛋白质。第三，应用生物信息学技术获取的数据进行存储、处理和比较。1，双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，1975年opalel和Klose首先在两个实验室分别建立了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(two dimensional poly acrylamide gel electrophoresis，2-DE电泳)。他们将isoelectrofocusing (I

5、EF)和SDS聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)相结合，构成二维电泳。开始是IEF，使用经典正电解质载体，在电流作用下形成pH梯度，并根据pI分离。第二个方向使用SDS-PAGE根据分子量大小进行分离。2，矩阵辅助激光解吸电离-飞行时间谱技术，矩阵辅助激光解吸电离-飞行时间质谱方法将多肽质量/电荷比与数据库数据进行比较，确认蛋白质。这种方法通常被称为钚质量指纹法。3，将光谱与光谱相结合，将光谱技术与新型光谱技术相结合，可以有效克服双向凝胶电泳/光谱的不足，确保分析的准确性。首先将蛋白质混合物切成酶，得到混合肽段，然后通过强离子交换反相色谱柱进行多次分离，使用液相色谱-串联质谱分析肽段，通过核素

6、标记肽段技术实现蛋白质定量分析。分离的产品离子经过良好的扫描，可以与分析肽段一起使用，以区分要测量的蛋白质和其他类似物。4，信息查询，生物信息学是生物学、计算机、应用数学相结合而形成的新学科。通过生物实验数据的收集、处理、存储、检索和分析，实现了解释数据中包含的生物学意义的目的。蛋白质组学研究所有物种基因组编码的完整蛋白质组，一般高吞吐量，在进行蛋白质功能预测和结构分析时，生物信息学成为蛋白质组学研究的关键技术之一。一些常用于分析的软件。PeptIdent是使用肽质量指纹谱数据确认蛋白质的查询软件，将数据库中的所有蛋白质“理论消化”到我们选择的酶中，形成肽片段，计算理论肽段的质量，生成索引，并

7、与输入的实验数据进行比较，根据实验数据中的匹配数排列和输出匹配结果。蛋白质的等电点、分子量、种类可以详细限制候选蛋白，减少假阳性误差。MS-Fit和Mascot软件利用MOWSE评分法具体考虑数据库中的段分布频率问题。Mascot软件还将MOWSE分数转换为绝对概率，从而减少结果的不确定性。proteomics相关网站，http:/www . proteome works . bio-proteome works研究技术，信息等。从新药开发的角度发现新的蛋和新的角色。http:/www . proteome . med . umich . edu可以找到研究相关企业、各种仪器来源、新闻等的蛋白

8、质组学。teome.co.uk有关各种蛋白质组研究的信息介绍http:/www.micromass.co.uk蛋白质鉴定的尖端仪器3358www.expasy.ch蛋白质鉴定专家系统，Swiss institute of bio informatics 3358 expasy.加拿大生物信息资源，2，功能性蛋白质组学技术，功能性蛋白质组学主要研究蛋白质功能、蛋白质蛋白相互作用、蛋白质小分子相互作用，方法主要是蛋白质排列技术(protein arrays)、噬菌体显示技术(parge display technology)共价结合目标蛋白，便于纯化和鉴定的化学探针无疑是

9、这个领域最重要的工具。利用化学探针，可以在纯化的蛋白质、细胞分解物、活细胞、活动物等不同层面评价药物作用的强度和选择性。一方面，可以识别与其他疾病相关的新药物目标。另一方面，可以用于药物先导化合物的快速检测，加速候选化合物应用于临床的过程。其中基于激活靶酶的特异性化学小分子探针(activity-based probes，ABPs)是一种新的化学蛋白质组学研究技术。activity-based probes，ABPs，该技术的原理是合成既有反应组又有标签组的ABPs试剂和正在研究的蛋白质组作用，因为ABPs是旨在研究靶酶活性的化学小分子，所以蛋白质组可以直接检测感兴趣的靶酶的活性。ABP的分子

10、量通常为700-1000 D，这主要是由报告团(荧光基团或生物素)引起的，这些报告团可以改变活性分子在体内的性质和与靶蛋白的作用模式，从而限制ABP分子在体内的细胞吸收和分布。ABPP实验通常在体外进行，例如细胞或组织匀浆等实验方式可以改变细胞或组织内活性酶或非活性酶的浓度以及各自的子细胞分布。因此体外功能蛋白质组学研究只能粗略地揭示蛋白质在活细胞或动物体内组织中的功能状态。1、不可逆探针、主要基础结构上、不可逆化学探针具有与酶共交联的反应器团、调节反应器团反应特异性的链接区和促进目标酶识别和纯化的标记物等三个不同寻常的功能部位。(1)反应团反应团提供靶蛋白所需的共价修饰。选择性的高低是化学探

11、针设计过程中最大的挑战。其困难在于功能团的二元性。一方面具有某些蛋白质中氨基酸残基的反应性，另一方面是不识别细胞或细胞提取物的其他活性片段。(2)连接区域通常使用长链烷烃或聚乙二醇作为化学探针的连接区域，连接反应组和标记。主要在反应器和标志物之间提供足够的空间防止空间障碍的形成，方便反应器和酶的结合和结合物的纯化。烷基链调节探针的疏水性，使其易于进入活细胞和组织。聚乙二醇链提高疏水探针的溶解性，易于进入水溶液。(3)标记物一般使用生物素、荧光物质和放射性物质作为化学探针的标记物，快速鉴别和纯化探针修饰的蛋白质。蛋白质凝胶电泳是最简单有效的蛋白质分离方法，因此用于显示探针的物质必须与SDS-pa

12、ge方法兼容。目前，该方法已成功用于丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、脱泛蛋白酶等靶标酶的功能蛋白质组研究，发现了与某些化学小分子在体内作用相关的新靶标。2，由于可逆探针、不可逆探针的设计，蛋白质(酶)活性中心结构信息、对小分子化合物的酶抑制部位信息等方面的限制不足，希望将可逆抑制剂直接用作化学探针。预计该方法将扩展到对所有靶蛋白的功能蛋白质组研究，用于新药筛选。3，未标记探针，ABPP实验在细胞或组织匀浆中继续进行。一个主要原因是报告团的体积大小(分子量通常为700，10，0DA)，限制探针分子的吸收、分布，甚至可能改变探针分子的作用模式。近年来，ABPP实验引入了click-chemistry，开

13、发了未标记的探针分子，报告团(荧光素或生物素)在探针分子以共价标记靶蛋白后，通过Huisgen 1，3-偶极，Sharpless等由Cu(I)催化的乙炔和氮杂环在温和的条件下，在未标记探针分子的设计中，应利用光亲和性标记技术引入光亲和性标记器，这起到探针分子和靶蛋白结合(可逆)后通过光解作用在探针分子和靶蛋白之间引入共价键的作用。通常，这些探针分子包括活动部位、光合作用指示器、连接和报告器。光亲和标记探针分子的光亲和团包括苯亚硝基类(phenyl azides)、三氟甲基二嗪(trifluoro methylphenyl diazirine)、苯并酮类(benzophenone)等。一般来说，

14、理想的光亲和团应具有以下几个特征： (1)具有一定的化学稳定性，能经受一般化学反应。(2)自然光中合理的稳定性；(3)在黑暗中照射稳定不损害生物样品的紫外线(300 nm)，容易光解。(4)光解后的活性中间体可与亲核的X-H(X=N，S，O)官能团和C-H官能团反应。光解中间体和受体作用下得到的产物必须相对稳定，能经受分离、纯化、分析等。光亲和标记-ABPP (CC-ABPP)实验仅限于目前起共价作用的探针分子的设计、研究，但在很多情况下我们能得到的活性小分子和蛋白质的作用方式是非共价的。此时，想将click-chemistry引入光亲和显示技术，设计具有非共价作用的探针，化学探针可用于功效研

15、究。分析了候选药物与化学探针之间的简单竞争耦合，对复杂蛋白质组中的药物靶标进行了鉴别。同时，利用更接近生理条件的天然酶，可以验证候选药的功效。还可以使用相关组织样本分析候选药物抑制特异性靶标的能力。利用化学探针，可以在纯化的蛋白质、细胞分解物、活细胞、活动物等不同层面评价药物作用的强度和选择性。化学蛋白质组学(chemical proteomics)是一个多学科交叉的领域，它大大提高了我们对生物学和药物开发的认识。共价结合目标蛋白，便于纯化和鉴定的化学探针无疑是这个领域最重要的工具。一方面，可以识别与其他疾病相关的新药物目标。另一方面，可以用于药物先导化合物的快速检测，加速候选化合物应用于临床的过程。利用基于激活靶酶的特异性化学小分子探针(activity -basedprobes，ABPs)检测功能性蛋白质组