上课 2.1 微生物的实验室培养

1、.,变酸？,.,巴斯德,法国，微生物学家,失败的原因：发酵物中混入了杂菌,.,课题1微生物的实验室培养,.,1.何为培养基？,3.各种培养基的具体配方不同，但其基本成分都相同，都包括哪些营养成分？,自主学习:,2.按照物理形态、化学成分，培养基的种类有哪些？,基础知识,(一)培养基,.,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,(一)培养基,1.概念：,.,液体培养基固体培养基,据物理性质分,2.类型及应用：,常用于工业生产,用于微生物的分离、鉴定、计数,加琼脂,半固体培养基,.,琼脂：,.,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,.,1.培养基：,微生物生存

2、的环境和营养物质,1.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,.,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的：碳源、氮源、能源。,.,(一)培养基,3.营养要素,还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。,如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、碱基),并非所有微生物都需添加特殊营养物质,此外：,.,牛肉膏蛋白胨培养基配方,牛肉膏5.0g蛋白

3、胨10.0gNaCl5.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000ml。,配方中的各成分为微生物提供了哪些营养？,(一)培养基,3.营养要素：,碳源、氮源、磷酸盐和维生素,氮源和维生素,无机盐,H2O,.,天然培养基（含有天然成分：如：牛肉膏、蛋白胨等）合成培养基,据化学成分分,2.类型及应用：,常用于工业生产,常用于分类、鉴定,.,液体培养基固体培养基,据物理性质分,天然培养基合成培养基,据化学成分分,选择培养基鉴别培养基,据用途分,2.类型及应用：,(一)培养基,常用于工业生产,用于微生物的分离、鉴定、计数,加琼脂,常用于工业生产,常用于分类、鉴定,培养、分离出特定微生物,鉴别不同种类的

4、微生物,在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。,根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成。,.,练习,下列有关培养基的叙述正确的是（）A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B.培养基只有两类：固体培养基和液体培养基C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基D.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌,A,.,要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（）A.固体培养基B.液体培养基C.加入青霉素的培养基D.加入高浓度食盐的培养基,A,练习,.,下列叙述错误的是（）A.培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素B.培

5、养霉菌时需将培养基中的pH调至碱性C.培养细菌时需将pH调至中性或微碱性D.培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件,B,练习,.,碳源、氮源、生长因子的比较,凡能提供所需碳元素的物质,凡能提供所需氮元素的物质,生长必不可少的微量有机物,构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养生物的主要能源物质,合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,酶、核酸等的组成成分,.,1、何为无菌技术？无菌技术包括哪些方面？2、消毒和灭菌的区别？3、常用的消毒方法有哪些？4、常用的灭菌方法有哪些？,自主学习：,(二)无菌技术,.,1.获得纯净培养物的关键：,防止外来杂菌的入侵,2.无菌技术包括：,1、对实验操作的空间、操作者

6、的衣着和手，进行清洁和消毒；2、用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；,(二)无菌技术,P15思考题,.,3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。,.,练习,下列操作与无菌技术无关的是（）A.接种前用肥皂洗双手，再用酒精擦拭双手B.接种前用火焰烧灼接种针C.培养基在50左右时搁置斜面D.在酒精灯火焰旁边完成,C,.,消毒使用较为温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。,3.消毒与灭菌,灭菌,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,理化因素的作用

7、强度,消灭微生物的数量,芽孢和孢子能否被消灭,(1)定义,.,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min，日常生活中广泛应用2、巴氏消毒法：70-75煮30min或80煮15min，牛奶、啤酒等不宜进行高温消毒的3、化学药剂消毒法:75%酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液等4、紫外线消毒法：用于接种室空气消毒,(2)消毒的方法：,3.消毒与灭菌,.,1、灼烧灭菌：用于微生物接种工具，如：接种环、接种针或其他金属用具等，及接种过程中试管口或锥形瓶口的灭菌,(3)灭菌的方法：,3.消毒与灭菌,.,2、干热灭菌：160-170下加热1-2h。用于玻璃器皿、金属用具等能耐高温、需保持干燥的物品。3、高压蒸气灭

8、菌：100kPa、121下维持15-30min.广泛用于培养基及多种器材、物品。,(3)灭菌的方法：,3.消毒与灭菌,.,P16请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手,答：（1）（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,.,练习,细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（）A.接种针、手、培养基B.高压锅、手、接种针C.培养基、手、接种针D.培养基、手、高压锅,C,.,变形题,培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手

9、、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是（）化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线消毒高压蒸汽灭菌巴氏消毒法A.B.C.D.,A,.,关于微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,D,练习,规律：对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是微生物的碳源，又是氮源；有机碳源能提供能量，无机碳源不能提供能量；无机物也可提供碳源、氮源和能源。,.,二、实验操作,1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,.,培养皿,.,二.实验操作(以培养大肠杆菌为例),.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算2.称量3.溶

10、化4.灭菌：将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力100kPa、温度为121，灭菌1530min。5.倒平板:待培养基冷却到50左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,.,倒平板操作,.,2.无菌范围：,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具灭菌,实验操作过程,酒精灯旁操作,超净工作台,.,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基

11、的温度？,.,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,.,三.菌落,.,单个或少数菌体,2.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。,3.功能：,1.定义：,三.菌落,鉴定菌种的重要依据,固体培养基上,大量繁殖,子细胞群体,.,2、纯化大肠

12、杆菌:,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,微生物的接种技术,.,.,划线后培养一段时间后,.,微生物的恒温培养,.,微生物的恒温培养,.,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量移液器,.,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,滴,灼,试,涂,.,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,

13、.,1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,.,2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么

14、总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,.,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,.,（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,.,（三）是否进行了及时细致的

15、观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,.,菌种的保存,1)、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2)、长期保存：甘油冷冻管藏法，-20,固体斜面,.,本课题知识小结:,.,【典例解析】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是:A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,解析：无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,.,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是:A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前,B,.,例3右表是某微生物培养基成分，请据