植物组织培养-植物器官培养

4植物器官培养植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。根、茎、叶、花器、果实、种子。4.1根的培养根系生理代谢研究的良好实验体系；研究器官分化、形态建成的良好体系；建立根无性系，用于制药；诱变育种。4.1.1离体根的培养方法固体培养法：平放液体培养法：振荡固体－液体双层培养法：根段形态学上端插入固体培养基，下端朝上浸露在液体培养基中。其他特殊方法4.1.2离体根所用培养基WhiteMS、B5等大量元素减半或减2/34.1.3影响离体根生长因素基因型营养条件：氮源、碳源、微量元素、维生素B1激素：生长素pH光照和温度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1茎段培养植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。4.2茎段和茎尖培养茎段培养的目的进行植物的离体快速繁殖。研究茎细胞的分裂潜力和全能性。诱导细胞变异和突变体的获得。茎段培养的特点和优点特点：以芽生芽的方法进行增殖。优点：容易成功、变异小、性状均一、繁殖速度快。茎段培养产物单苗（芽）丛生苗（芽）单生芽和丛生芽的增殖方式适宜植物的离体快速繁殖。完整植物愈伤组织影响因素基因型激素配比：生长素、细胞分裂素4.2.2茎尖培养茎尖培养（shoottipcultureorapicalmeristemculture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。材料茎尖分生组织培养：<1mm(带有1－2个叶原基的生长锥），可去毒。普通茎尖培养：几毫米至几十毫米的茎尖、芽尖及侧芽培养。Shoottipculture

茎尖培养的一般方法材料制备：精心预处理严格灭菌小心取材：体视显微镜、解剖针茎尖培养注意事项取材大小：脱毒小于1mm，快繁可数毫米。茎尖微小趋向于形成愈伤组织。培养基：多为MS，避免2,4-D（促使外植体愈伤组织化）。茎尖分生组织培养与脱毒普通茎尖培养与繁殖技术无菌物的建立芽的增殖中间繁殖体的增殖诱导生根移栽概念：Micropropagation生长状态及原因生长太慢：茎尖不见明显增大，但颜色转绿。进入休眠生长素太低温度低生长过旺：茎尖明显增大，基部产生愈伤组织，茎尖难于伸长，色泽较淡。生长素偏高用了2,4-D光照太弱温度过高生长正常：茎尖逐渐转绿，基本逐渐膨大，有时形成少量愈伤组织，茎尖逐渐伸长，最终形成小枝。影响茎尖微繁的因素基因型外植体的大小供试植株的生理状态芽的着生部位褐变玻璃化极性后生变化形态发生能力遗传稳定性4.3叶的培养离体叶：叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织。意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种。影响叶组织培养的因素基因型细胞分裂素细胞分裂素和生长素的组合供试植株的发育时间和叶龄叶脉极性损伤离体叶组织发育途径直接产生不定芽由愈伤组织产生不定芽胚状体其他将镊子、解剖刀置于含有70％酒精的清洁瓶内。叶片浸于该液1分钟作表面消毒。将叶片置于10％漂白粉水溶液中（1/4杯漂白粉+2¼杯水+几滴洗洁精）10分钟，并不时用镊子搅动。如果叶片浮在水上，则需用镊子夹入水底。10分钟后，将漂白粉水溶液中的叶片转移到盛有无菌水的瓶子内，一次放入一片。将叶片转移到消毒过的盘上准备切割。切去叶的边缘，再将剩下的叶片切成2－4片，并分别将它们接入紫罗兰培养基上。经消毒的非洲紫罗兰叶片切成0.5-1英寸宽，接种与新鲜的培养基上。3周后叶片周围及表面肿胀，并有芽生成。芽伸长成苗。有时叶片表面都被诱导的芽所包围。接种5－6周后将接种的叶片1分2，并转入无激素的培养基中以利于苗的生长及生根。一个即将用于移栽的生根的紫罗兰试管苗。移栽到土壤中的小苗的前几天要用塑料袋罩上，直到小苗适应低湿度的环境。复习思考题植物根培养主要有哪几种方法？什么是茎段培养？有何特点及用途？何谓茎尖培养？有何类型？需注意什么？叶培养有哪些意义？

建立和发展阶段（上世纪60年代至今）从植物细胞全能性理论的提出到其被实验科学地证实，植物组织培养研究领域走过了近60年的发展历程。当影响植物细胞分裂和器官形成的机理被揭示后，学者们对该领域进行了全面研究，获得的成果枝繁叶茂，发表的文章浩如烟海，形成了一套成熟的植物组织培养的理论体系和技术方法，拥有着极其广泛的应用领域，从而在生物科学中建成了这门具有理论、技术和应用的科学。1.Thimann和Wickson1958年，他们发现腋芽（当顶芽存在时为休眠状态）的生长，可以通过外源细胞分裂素的应用而启动。这样，将茎段培养在含有细胞分裂素的培养基上，就可以在一个具有完整顶芽的生长中的茎上诱导侧芽的形成。这将消除顶端优势，得到大量不定芽。Thimann2.Morel－脱毒、快繁商业化1952年，

Morel和Martin提出了植物脱毒（virusfree）技术，通过分离已被病毒感染的大丽花个体的根尖，并将其离体培养，重新获得了无病毒的大丽花。1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖（rapidclonepropagation）的两个目的。这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。Morel3.MurashingeMurashinge发展了一套标准的离体繁殖方法，将这一技术广泛普及。与Skoog一起筛选出至今仍被广泛应用的MS培养基。4.Guha和Maheshwari等——花药培养1964-1966年，印度学者Guha和Maheshwari成功地由曼陀罗花药培养获得单倍体植株，开创了花粉培育单倍体的新途径。1973年，Nitsch采用花药预培养方法获得了烟草花粉植株的纯合二倍体。1974年，Sunderland建立了散落花粉系列培养法。1982年，Ghandimathi和Imamura直接分离花粉进行培养成功，建立了一个适于深入研究雄核发育的实验体系。MaheshwariNitschNitsch发展了培养烟草和曼陀罗小孢子的技术、单倍体染色体加倍的技术，并且在5个月之内收集到二倍体纯合子的种子（Nitsch,1974,1977）。5.Cocking等-原生质体培养1960年，英国学者Cocking首次用酶解方法获得了原生质体，开创了植物原生质体培养的研究。1971年，日本学者Nagata和Takebe首次将烟草叶肉原生质体培养出再生植株。1985年，Fujimura获得首例禾谷类——水稻的原生质体培养的再生植株。1986年，Spangenberg获得了甘蓝型油菜的原生质体培养的再生植株。Cocking6.Carlson等——原生质体融合1972年，Carlson利用硝酸钠进行了烟草种间原生质体的融合实验，获得了首株体细胞种间杂种植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（PEG）进行了大豆和烟草科间原生质体的融合，获得了3％的异质体。同年，Bonne和Eriksson利用PEG成功进行了具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体的融合。1978年，Melchers获得了首个属间杂种植株（马铃薯番茄）。1981年，Zimmerman提出了原生质体融合的新方法——电融合。Melchers植物遗传操作成功的前景引起了大众的兴趣。Melchers和他的同事（1978年）通过将马铃薯和番茄原生质体融合，允许遗传信息在两个不同的有机体中移动，获得了一个杂种植物。这一方法提供了获得亲缘相近但生殖隔离的种间杂种的机会。7.Kaul等——次生代谢物生产1969年，Kaul发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基。1973年，Furuya和Ishii发现人参培养细胞可以产生人参皂苷。Nickell组织培养的先驱，尤其是在培养中次生代谢物质的生产方面。Street－培养设施化Street和他的助手开创了各种细胞悬浮培养的程序（恒化器和恒浊器）。0.3植物组织培养的应用及展望快繁和脱毒育种次生代谢物生产种质保存在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用1.离体快繁（试管苗和人工种子）和脱毒1）试管苗在生产上应用最广泛、经济效益较大。特点：繁殖系数大、速度快，苗木整齐一致，周年生产。一个单株一年繁殖几万到几百万个植株。葡萄：3万，兰花：400万，草莓：108。尤其适用于“名、优、特、新、奇”品种、脱毒苗、优良单株、濒危植物和基因工程植株等的繁殖。目前园艺作物及经济林木等部分或大部分都用离体快繁提供苗木。美国Wyford国际公司年产花卉、蔬菜、果树及林木的组培苗3000万株。以色列Benzur苗圃年产观赏植物组培苗800万株。我国工厂化生产的组培苗有：香蕉、甘蔗、桉树、葡萄、苹果、脱毒草莓、脱毒马铃薯、非洲菊、芦荟。Fig.1.Masspropagationofmultipleshoot

culturesof

Artemisiaannua

青蒿2）人工种子（artificialseed）人工种子的概念是1978年Murashinge首次提出的，它是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。具有试管苗的优点外，还具有以下优点：1）便于贮藏和运输、可直接播种和机械化操作；2）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质。前途是光明的，道路是曲折的。人工种子3）脱毒苗木培育很多作物特别是无性繁殖作物都带有病毒，影响产量和质量，对生产造成极大损失。草莓主要病毒有4种，大蒜和马铃薯的病毒有10多种。感病植株并非每个部位都带有病毒，生长点附近的病毒浓度很低甚至无毒。利用茎尖组培，再生植株就可脱毒，获得脱毒苗。应用：水果（甘蔗、菠萝、香蕉、葡萄、草莓等）、蔬菜（马铃薯、大蒜、洋葱等）、花卉（兰花、菊花、唐菖蒲等）等。茎尖培养用于脱毒2.培育新品种或创制新物种单倍体育种离体选择突变体培育远源杂种基因工程育种单倍体育种手段：花药和花粉培养优点：所有基因均能表现，基因型可快速纯合。成果：已育成大面积种植的品种。1974年我国育成第一个新品种——烟草单育1号，此后还育出水稻中花8号、小麦京花1号和大量花培新品系。单倍体植株单倍体加倍离体选择突变体愈伤组织、悬浮培养细胞易变异、细胞数量大，有利于突变体筛选。多用于抗性筛选。已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产。体细胞变异突变体筛选培育远源杂种胚培养可克服受精后障碍导致的远源杂交不孕，产生远源杂交后代，育成新物种。已育成苹果和梨、大白菜和甘蓝、栽培棉和野生棉等杂交种。原生质体融合可克服有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种。已获得马铃薯和番茄、烟草和龙葵等属间杂种，但尚无实际应用价值。典型的原生质体烟草原生质体Aechmeafasciata(X400)Ti导入的原生质体原生质体远缘杂交基因工程育种农杆菌介导法、基因枪法均基于植物组织培养技术。抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆性、品质改良。转基因作物已占种植面积的1/5左右。转基因技术基因枪技术3.次生代谢物生产利用组织和细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。已从200多种植物的培养组织或细胞中获得了500多种有效代谢化合物，包括一些重要药物。如人参皂苷、喜树碱、降压灵等。特别适于天然植物蕴藏量少、含量低、临床效用高的成分，如紫杉醇等。Fig.2.Scale-upofCatharanthusroseus长春花cell

culturesina20litreair

紫草发酵罐培养4.植物种质资源的离体保存常规保存手段耗费人力、物力和土地。1