T-CAQI 385-2024 棉花品种溯源SSR 分子标记法

棉花品种溯源SSR分子标记法Cottonvarietytraceability—SSRbas中国质量检验协会发布IT/CAQI385-2024前言 II 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15原理 26试剂与溶液 27仪器设备 38品种溯源检测程序 39数据分析 410结果报告 4T/CAQI385-2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由阿拉尔市南博农业科技服务有限责任公司提出。本文件由中国质量检验协会归口。本文件主要起草单位：浙江工业职业技术学院、北京服装学院、绍兴市工业设计协会、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、新疆棉城种业有限公司、洁丽雅家居股份有限公司、阿克苏苏嵘纺织有限公司、新疆忠富纺织科技有限公司。本文件主要起草人：汪芳、龚䶮、陈爱亮、潘春平、张娟、郭晟材、高荧羲、刘清明、王利胜、姚知含、张峰、张明武。本文件为首次发布。T/CAQI385-2024棉花品种溯源SSR分子标记法本文件规定了品种溯源的概念、棉花品种溯源的原理及利用简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）标记进行棉花品种溯源检测的操作、数据分析、结果判定。本文件适用于棉花品种溯源。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2634—2022棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法3术语和定义NY/T2634—2022界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1品种溯源varietytraceability供检品种与文件记录（如标签等）是否相符以及品种间在DNA分子标记带型上的一致性：指通过比对检测样品或产品附带的文件记录（如标签、清单等），并进行DNA分析，判断其品种是否与文件记录一致，并评估不同品种之间在DNA分子标记带型上的相似性水平。4缩略语下列缩略语适用于本文件。SSR：简单重复序列(SimpleSequenceRepeat)DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)PCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(CetyltrimethylammoniumBromide)SDS：十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate)PVP40，PVP30：聚乙烯聚吡咯烷酮（PolyvinylPyrrolidone）2T/CAQI385-2024吐温-20：聚山梨醇酯-20（Tween-20）5原理棉花的不同品种含有各自特征性的DNA序列信息，根据SSR序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR技术扩增和电泳分析，获得单一品种棉纤维的SSR电泳带型。将受检样品与标准样品的带型逐一进行差异比较和判读并分析，进行棉花品种的溯源。6试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。6.1无水乙醇（C2H5OH）。6.2氯仿（CHCl3）。6.3异戊醇（C5H12O）。6.4异丙醇（C3H8O）。6.5乙酸钾（CH3COOK）。6.6乙酸钠（CH3COONa）。6.7氯化钠（NaCl）。6.8β-巯基乙醇（C2H6OS）。6.9聚乙烯聚吡咯烷酮（(C6H9NO)40，(C6H9NO)30）。6.10乙二胺四乙酸二钠二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）。6.11三（羟甲基）氨基甲烷（C4H11NO3）。6.12十六烷基三甲基溴化铵（C19H42BrN）。6.13十二烷基硫酸钠（C12H25SO4Na）。6.14Tween-20吐温-20（C26H50O10）。6.15CTAB裂解液：分别称取三（羟甲基）氨基甲烷（C4H11NO3）12.11mg、乙二胺四乙酸二钠二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）3.72mg、十六烷基三甲基溴化铵（C19H42BrN）20g、PVP2mL，定容至1000mL，调整pH至8.0，4℃保存备用。6.16SDS裂解液：分别称取乙酸钠（CH3COONa）8.20g、乙二胺四乙酸二钠二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）18.61mg、氯化钠（NaCl）29.22g、十二烷基硫酸钠（C12H25SO4Na）20g、PVP40[(C6H9NO)40]1g和β-巯基乙醇（C2H6OS）2mL，溶解于800mL水中，定容至1000mL，4℃保存备用。6.17乙酸钾溶液：称取490.70g乙酸钾（CH3COOK），溶解于800mL水中，定容至1000mL，终浓度为5mol/L，4℃保存备用。3T/CAQI385-20246.18TE溶液：分别称取1.21g三（羟甲基）氨基甲烷（C4H11NO3）、0.37g乙二胺四乙酸二钠二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O），溶解于800mL水中，用浓盐酸(HCl)调pH至8.0后定容至1000mL，4℃保存备用。7仪器设备7.1聚丙烯凝胶电泳系统。7.2PCR扩增仪：±0.25℃（35℃~99.9℃)7.3高速冷冻离心机：最大离心力≥10000g。7.4水浴锅或金属浴：温控精确度±1℃。7.5紫外分光光度计。波长范围：190nm～900nm。7.6凝胶成像系统。7.7微量移液器：2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。7.8电子天平：感量0.1g和0.1mg。7.9酸度计：精度±0.01pH。7.10高压灭菌锅。工作压力：≤0.35MPa。8品种溯源检测程序8.1引物应按照NY/T2634—2022的6.3规定的SSR核心引物。8.2棉花DNA提取称取200mg～300mg棉纤维样品，充分剪碎并用液氮研磨。加入1.5mLCTAB裂解液，充分混匀后，于65℃中水浴30min，水浴过程中颠倒离心管数次。加入等体积的氯仿-异戊醇(24︰1)抽提液，缓慢颠倒多次后，于4℃,12000r/min条件下离心10min。将上清液转入新的离心管中，并加入60%体积-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，而后-20℃静置20min。4℃,12000r/min条件下离心2min，弃上清液。向离心管中加入600μL体积分数为70%的乙醇水溶液，4℃,12000r/min条件下离心2min，弃上清液。用70%的乙醇水溶液重复洗涤1次。加入无水乙醇，4℃,12000r/min条件下离心2min，弃掉废液，室温晾置2min。加入40μLTE溶液充分溶解DNA，4℃保存备用。8.3DNA质量控制移取适量提取的DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性。要求DNA条带整齐、未见明显降解。移取适量提取的DNA，适量稀释，用紫外分光光度仪检测DNA的浓度和纯度。较纯DNA样品的A260/A280比值为1.8左右；若该比值大大低于1.8，说明样品中含有较多的蛋4T/CAQI385-2024白质，需要进一步纯化。DNA浓度按式（1）计算：DNA浓度(μg/mL)=M×OD×50………式中：M——稀释倍数；OD——DNA的浓度，即A260/A280比值。对于双链DNA来说，1OD相当于50μg/mL。8.4PCR扩增按照NY/T2634—2022的8.2执行。8.5扩增产物分离按照NY/T2634—2022的8.3执行。9数据分析按照NY/T2634—2022的8.4执行。10结果报告10.1对品种真实性验证或身份检测的结果进行表格填报。10.2对于真实性验证，选择下列方式进行填报：通过对引物，采用电泳方法进行检测，与标准样品比较检测出差异位点数个，差异位点的引物编号为，检测意见为：10.3对于品种身份检测，采用下列方式进行填报：a)通过对引物，采用电泳方法进行检测，经与SSR指纹数据库筛查，供检样品与品种未检测出位点差异，检测意见为：b)通过对引物，采用电泳方法进行检测，经与SSR指纹数据库筛查，检测到供检样品与品种位点差异为1或2，检测意见为：