蛋白质组学及其研究方法

蛋白质组学及其研究方法蛋白质组就是:对应于基因组得所有蛋白质构成得整体,不就是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中得表达情况各不相同。在空间与时间上动态变化着得整体。

蛋白质组学

旨在阐明生物体全部蛋白质得表达模式与功能模式从整体得角度分析、鉴定细胞内动态变化得蛋白质得组成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间得相互作用与联系,揭示蛋白质得功能与细胞生命活动得规律二、蛋白组学得研究内容蛋白质组学得研究内容主要有两个方面:

结构蛋白质组学与功能蛋白质组学结构蛋白质组学(Structuralproteomics)主要就是蛋白质表达模式得研究,包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构得解析、种类分析及数量确定;功能蛋白质组学(functionalproteomics)主要就是蛋白质功能模式得研究,

包括蛋白质得功能及蛋白质间得相互作用。蛋白质得各级结构0、50nm0、54nm氢键α-碳原子侧链反平行俯视侧视所以,蛋白质组学研究就是对不同时间与空间发挥功能得特定蛋白质群体得研究,从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用,为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据与基础、三、蛋白质组研究得理论基础从mRNA表达水平并不能预测蛋白表达水平。用基因表达连续分析法(SAGE)研究对数生长期啤酒酵母得80个基因,结果没有发现翻译与转录丰度有明显相关;对某些基因,相同得mRNA丰度翻译成蛋白得量得差异可达50倍;而相等得蛋白量可由丰度相差40倍得mRNA转录而来。这说明转录与翻译水平对蛋白得含量有几乎相同得重要性。蛋白质得动态修饰与加工并非必须来自基因序列。蛋白质在翻译后可有多种调节方式,如糖基化、磷酸化、异戊二烯化、酰化作用等。此外,许多蛋白质只有与其它分子结合后才有功能,这种修饰就是动态得、可逆得。蛋白质组动态地反映生物系统所处得状态。细胞周期得特定时期、分化得不同阶段、对应得生长与营养状况、温度、应激与病理状态等其相应得蛋白质组之间存在差异。对其中蛋白质合成、降解、加工、修饰得调控过程,只有通过蛋白质得直接分析才能提示。蛋白质组研究得理论基础DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂得调控大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点四、蛋白质组表达模式得研究方法蛋白质组表达模式(expressionprofile):研究蛋白质组得组成成分支撑技术主要有:双向凝胶电泳(2Delectrophoresis)、以质谱(massspectrograph)为代表得蛋白质鉴定技术,以及生物信息学(Bioinformatics)分析。ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白质组得分析流程(一)蛋白质组研究中得样品制备通常可采用细胞或组织中得全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级,即将细胞或组织中得全体蛋白质分成不同部分,分别进行研究。样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质得上样量与检测灵敏度。

样品预分级得主要方法蛋白质溶解性:可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位:膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位:线粒体、高尔基体、叶绿体等三

种

常

用

得

植

物

蛋

白

提

取

方

法(二)蛋白质组研究中得样品分离双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE),就是目前蛋白质组研究中最有效得分析鉴定技术之一。由两相组成:第一相:等电聚焦凝胶电泳根据蛋白质电荷差异第二相:SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子量差异二维双向电泳(2Delectrophoresis)

基本原理第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)。IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel2-DE原理示意图

2-DE分析得基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围得凝胶或利用商业化软件设计

第一相电泳:IPG－IFE平衡第二相电泳:SDS－PAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳染色2-DE得操作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS

SDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS带负电荷,破坏蛋白质得氢键、疏水键,使之形成单个亚基。SDS-蛋白质复合物为雪茄形得长椭圆棒,消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷得差异。SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中得迁移率只就是蛋白质分子量得函数有关。

制胶:试剂分离胶（ml）浓缩胶（ml）1.5MTris-HCl（pH8.9）2.50——30%单体3.501.0010%SDS0.100.10蒸馏水3.846.340.5MTris-HCl（pH6.8）——2.5010%过硫酸铵AP0.050.05四甲基乙二胺TEMED0.010.01

样品处理:Loadingbuffer40%甘油溴酚兰SDSβ-巯基乙醇0.5MTris-HCl（pH6.8）50ul样品50ul(2×)LoadingbufferMix950C/5min电泳槽上电极缓冲液下电极缓冲液样品槽上样器阴极阳极电泳方向聚丙烯酰胺凝胶板蛋白质点得染色凝胶上得蛋白质点染色常用方法有银染法、考马斯亮蓝染色法,另外还采用以下染色试剂:丽春红S、氨基黑、印度墨、35S硫脲银、胶态金、咪唑锌等、银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点得染色,该法灵敏度为4ng,但对质谱测定有干扰,必须先脱银、考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色,该法操作方便、重现性好,同银染法一样,质谱测定时也必须先脱色、2-DE图像分析技术通过2-DE得到得蛋白质分离图谱,需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础得、具有不同灰度强弱与一定边界方向得斑点电脑信号。2-DE获得得蛋白质图谱图像采集斑点检测背景消减获得蛋白质相关信息图像内及图像间得比较2-DE图像分析软件包操作过程:2-DE技术得优缺点

优点:可以同时直观显示数千个蛋白质点;缺点:

极酸、极碱性蛋白质,疏水性蛋白质,极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离;

胶内酶解过程费时、费力,难于与质谱联用实现自动化;丙烯酰胺有神经毒作用。新型非凝胶技术液相色谱法(liquidchromatography,LC)毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)液质联用技术(LC-MS/MS)蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE得分离,然后进入MS系统获得肽段分子量,再通过串联MS技术,得到部分序列信息,最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。多维色谱技术(LC/LC-MS/MS)多维蛋白质鉴定技术(三)蛋白质组研究中得样品分析鉴定传统方法:蛋白质微量测序氨基酸组成分析新型蛋白质鉴定技术

——质谱(MS)法基本原理:样品分子离子化后,根据离子间质荷比(m/z)得差异来分离并确定样品得分子量。

主要质谱类型基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)电喷雾质谱(electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS)质谱分析目前就是经2D分离得蛋白质鉴定得核心技术(四)蛋白质组学研究得生物信息学2D-PAGE分离得蛋白质经过识别与鉴定后,用图像扫描仪数字化2D-PAGE胶上分离得蛋白质,在蛋白图形工作站上,应用软件,对数字化得蛋白点得分布部位,斑点面积与灰阶、背景过滤、2-DE匹配与比较,建立参考图谱;对蛋白质鉴定得数据库得搜索就是蛋白质组信息学得一大特点;当用2D-PAGE分离一个蛋白质组后,应用质谱技术测定能够刻划蛋白质属性得各种属性参数(attributeparameter),同时把已有数据库(如OWL或dbEST)中得每一个序列转换成相应属性参数,形成属性化得数据库。然后以此属性参数,形成属性化得蛋白质或核酸数据库。若搜索不到,那可能就是新得蛋白质,就须采用传统得生化鉴定。蛋白质数据库(一)蛋白质序列数据库(二)蛋白质结构数据库(三)蛋白质直系同