生命科学与技术学院《APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用及机制》项目申报

1项目申请书项目名称APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及指导教师起止年月21、申请书所列各项内容均须实事求是填写，表达明确严谨，简明扼要。模板可网上下载、自行加页。2、申请书首页只填写项目负责人。"项目编号"一栏可不填。3、项目负责人所在院系须认真审核，签署推荐意见并加盖公章后3名称APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用及机制所属学科学科一级门：理学生物科学申请金额起止年月2023年7月至2024年7月负责人姓名XX性别男民族汉出生年月2003年5月学号联系电话指导教师XX联系电话负责人曾经参与1.参与基金项目"构建3D工程化共培养模型探究乳腺癌肺转移的发生发展及药效评估”中材料物理性能的检测；指导教帅承担科1.构建3D工程化共培养模型探究乳腺癌肺转移的发生发展及药效评估，国家自然科学基金(青年基金),在研，主持。2.山东省高等学校青创团队课题“功能性生物材料开发与类器官构建及应用的研究",在研，主持。3.基于工程化肿瘤模型探究乳腺癌肺转移发生发展机制，山东省4.基于脱细胞基质肺转移模型中细胞间及细胞-基质间相互作用的研究，潍坊医学院博士基金，在研，主持。指导教师对本项目的支持情况1.指导教师对本项目中实验设计进行指导完善，对项目书的撰写进2.指导教师在本项目中多糖结构分析、支架的制备、组织工程肿瘤模型的构建及生物学检测、药物活性检测等验，可在整个项目的实施过程中进行阶段、任务、步骤的规范和确认，保证项目的顺利进行。3.对本项目中前期预实验需要的试剂及耗材的花费以及可能超过4项目组主要成员学号专业班级所在学院项目中的分工2021级生物制药生命科学与技术学院多糖生物活性检测及模型构建2020级生物制药生命科学与技术学院生物学实验及数2022级生物技术生命科学与技术学院支架性能检测及3D模型构建2022级生物技术生命科学与技术学院多糖活性检测肺癌的患病率和死亡率均居癌症前位，临床治疗仍是一大挑战耐药性。从天然产物及中草药中寻找毒性低且疗效好的抗肿瘤活性成分成为研究热转移有抑制作用，对肺癌患者维持治疗具有临床可行性，使用APS协同顺铂可显著改善临床症状。作为肿瘤生物学研究的工具而言，三维(Three-dimen于此，本研究拟基于脱细胞猪肺基质/明胶支架构建体外3D肺癌模型，并进一步探究APS协同顺铂抑制体外抗3D工程化肺癌生长及转移的作(1)考察APS和顺铂物理化学及结构，结合已有文献，确定其生物活性发挥的可能因素；(2)分别制备脱细胞猪肺基质dECM及dECM/明胶复合支架，对支架表观形貌、结构及5察支架上细胞分布、渗透、生长增殖情况以评估构建模型的可行性，考察3D模型相比(3)利用3D工程化肿瘤模型初步探究APS协同顺铂对肺癌生长及转移的作用及机制，为APS在动物体内发挥减毒增效作用提供实验依据，从而为APS临床应用于肺癌患者(a)查阅文献及预实验确定APS的最佳浓度范围，通过SEM、活死染色、CCK及DAPI染色考察APS对肺癌细胞株是否具有直接的抑制活性；(b)考察APS联合顺铂两药对肺癌A549细胞的增殖抑制作用的关系，通过检测考察APS变化，APS糖协同顺铂是否增强肺癌A549细胞的促凋亡作用及抑制细胞的生长与转(a)经过查阅文献和前期预实验，采用胰蛋白酶、TritonX-100和SDS结合对新鲜的猪肺组织进行脱细胞处理，并使用0.1M盐酸溶液与胃蛋白酶结合溶解脱细胞基质，脱细胞优的脱细胞组合方案。(b)根据猪肺基质脱细胞过程胶原及糖胺聚糖的损失情况，确定加入脱细胞肺基质、明胶两者的质量比。根据人体肺泡结构、孔径大小和肺脏机械强度(c)通过试验设计探究不同预冻温度、预冻速率、预冻时间对干燥dECM表观形貌、孔dECM力学性能、热稳定性、孔隙率、交联度及降解率等物理性能的影响，明确最佳的(d)系统检测交联后的dECM/明胶用于组织工程模型的理化性能(宏观及微观结构、孔隙率、孔尺寸、吸水率、生物力学性能);初步确定复合支6(3)APS协同顺铂抑制3D培养肺癌生长的作用及机制(a)通过试验设计确定肺癌细胞-脱细胞基质肿瘤模型用于研究药物作用的适宜细胞密度及APS、顺铂体外作用肺癌细胞的适宜浓度；对比无APS干预组，从其对免疫细胞及其细胞周期的阻滞层面探究APS协同顺铂抑制肺癌细胞生长及转移的相关机制。养的肺癌A549细胞生长的影响，并考察其抑制机制。(c)探究APS协同化顺铂抑制体外3D培养工程化模型中肺癌细胞生长的作用及机制，主要包括干扰细胞周期和促进细胞凋亡等方面。观察APS联合顺铂对肺癌A549细胞细(四)国、内外研究现状和发展动态肺癌所有病例的80%至85%,近二十年肺癌的发病率每年以11%左右的速度递增1]。由药物治疗肺癌已迫在眉睫2。越来越多的科学研究表明，来自天然资源(植物、动物和真菌)的多糖在预防或治疗癌症方面具有广阔的前景。目前最具代表性的多糖是香菇多糖的抗肿瘤生物活性是通过直接杀伤肿瘤、增强免疫功能和协同化疗实现的3。副作用、改善患者身体状况及延长生存时间等polysaccharides,APS)应用于临床且疗效显著,但是大多作为辅助抗癌药物使用，其抗论依据，使黄芪多糖更好的在临床治疗中发挥作用。APS是从黄生物活性成分(图1A-B),可促进巨噬细胞、自然杀伤细胞、树B淋巴细胞和小胶质细胞的活性，并诱导多种细胞因子和趋化因子的表达。黄芪多糖的7免疫调节作用使其有望用于治疗多种疾病，包括癌症、感染、I型糖尿病、哮喘和自身免疫性疾病。其中，抗癌作用最为突出5。AACacD种药理作用。目前，黄芪多糖具有开发改善或治疗不同疾病的药物的巨大潜力。更重顺铂(图1C)是多种恶性肿瘤的临床常用铂类化疗药物，能破与各种生物分子相互作用。根据软硬酸碱(HSAB)理论，PtII是一种软酸。与HS甘肽等含硫亲核试剂以及蛋白质的半胱氨酸残基7。然而，它们反应，特别是含氮的供体，如DNA和RNA中的核碱基，蛋白质和多肽中的组氨酸残8性的化疗药物-顺铂，具有普遍的癌细胞杀伤效应，但是仍然难免有部分肺癌患者仍会的耐受性及依从性。据报道，65-95%的顺铂可在给药后24小时内与血浆蛋白结合。剩与顺铂摄取。顺铂引起CRT1浓度的降解，导致癌细胞顺铂积累降低。CTR1表达越高的细胞顺铂积累量越高，对顺铂的敏感性越高，同时顺铂也可诱导细胞膜细胞凋亡0。前为修复受损DNA提供了时间。顺铂激活检查点激酶Chk1和Chk2,阻滞。取消这些抑制可能导致癌细胞死亡，迫使癌细胞在未修复的DNA损伤面前过早地重新进入细胞周期，从而通过NER途径促进细胞凋亡。肿瘤抑制蛋白p53是一种短保持稳定性，因此它也被称为“基因组的守护者”[。敏感性用于肿瘤的治疗。在体外实验中，虽有少部分研究发现APS可以直接抑制癌细抑制三维培养的肺癌A549细胞生长与转移的可能作用机制，为黄芪多糖通过发挥其抗细胞、成纤维细胞和免疫细胞14]。肿瘤微环境的特点是低氧、低营养细胞和细胞外基质之间的相互作用是通过整合素调节的，从而产生了对肿瘤的反馈回路。整合素直接与ECM成分相互作用，为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供必要的牵引力。9图2.原发性肿瘤进展和TME内复杂的相互作用[13目前研究癌症进展和抗癌药物筛选的主要工具是肿瘤模型，现有模型大致分为三类：2D细胞模型、3D模型和动物培养模型。截止到目前为止，2D细胞培养仍然是大多数肿瘤研究的主要方式，但2D培养缺乏肿瘤在体内的微环境，无法真实反映肿瘤在养系统不能反映肿瘤组织的高复杂性和生物学特征。因此，细胞在2D培养环境中对药|筛选和疗效研究中最常用的动物模型是皮下移植瘤，它允许复杂的肿瘤-基质细胞相互立的，肿瘤细胞被注射到皮肤下6。然而，一个完整功能免疫系统的缺陷也可能影响肿导，在癌症相关研究中是必不可少的。传统的2D细胞培养和动物模型已被证明在解释癌细胞行为和解释可能机制的假说方面是有效的。然而，一种定义良好的3D诊断和治疗应用中获得了浓厚的兴趣。生物学研究表明，细胞在3D建模环境中可能具和活性[17]。典模式依赖于生物材料支架、细胞和生物活性分子的组合来协调组织的形成和在宿主环境中的整合。组织工程的一个重要途径是开发生物材料，通过有效地运输细胞群体和治疗剂，以及提供赋予组织足够机械性能的结构支架来促进再生过程。随着组织工程学的快速发展，运用同样理念产生的3D组织工程肿瘤技术受到了众多关注，呈现出多样化发展趋势。基于支架形成肿瘤球的模型中支架材料的使用提高了3D培养模型的多样性，增加了基质的刚度和孔隙率等因素，以模拟某些肿瘤的微环境，这些物理因素的加入可以改变基因表达和细胞信号传递[18。A图3.细胞外基质主要成分示意图[19近年来，组织工程学的概念逐渐深入到生命科学研究的诸多领域，其传统设计方案中基于支架或基质材料的3D组织培养系统，能够尽可能地接近天然ECM的生物、物理及生化环境，并通过各类的模块化组织工程技术，促进其在替代或修复临床组织缺损之外的非治疗医学领域的应用。组织工程支架的制备已成为科学研究热点，各种各样的生物材料和一系列的技术用于制备组织工程支架，用于身体中不同组织和器官的再生。无论组织的类型，支架在设计和应用时一些关键的因素是必须被考虑的。细胞外基质不仅在确定肺的三维结构和物理性质方面起着重要作用，而且在包括细胞黏附、分化、生长和增殖在内的各种细胞活动中也起着重要作用。该基质由多种结构和功能成分组成，如胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白(图3)。天然ECM中存在的一些关键分子，包括蛋白质和生长因子，也是信号传递所必需的19。成功的脱细胞手术将消除细胞成分，同时保留由胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白组成的肺ECM,并将准确保留呼吸道和血管复杂分级分支结构。随着脱细胞技术的发展，脱细胞基质广泛应用于再生医学和组织工程领域并取得重大进展(图4)。与此同时，科学家们也积极开发利用脱细胞基质的新的应用领域，目前的是，每种支架都有其特定的生化和机械信号，进而产生不同的细胞Temperature/Force/PrMesenchymalStemCelMesenchymalStemCel ChemicalNon-lonic/BasesHypCombined&NovelDecellularizationMethods Postprocessing&RecellularizationMe图4.脱细胞ECM的制备及其在组织工程的应用[20]多糖保护重要器官免受毒性，还通过改变自噬或触发凋综上所述，研究APS抗癌机制有助于为其临床应用提供更多理论依据。APS具有抗肿瘤的作用，其机制复杂，既往的实验研究表明，APS对肿瘤细胞G1期具有阻滞作用，为APS抗肿瘤及协同化疗药物抗肿瘤研究提供了实验依据，APS协同顺铂抑制了体外3D工程化肺癌细胞的生长与转移，对于抗肿瘤的体外研究而言，3D组织工程肿瘤模型可有效弥补传统2D培养及体内动物模型的不足，为研究肿瘤细胞外基质所具有的生化及机械性能。目前，组织/器官脱细胞基质可极大程度保留原胞外基质成分，其优越的生物相容性、3D拓扑结构及生物力学性能进一步改善肿瘤细胞生长微环境，为后续组织工程肿瘤构建提供结构基础。基于脱细胞基质/明胶构建的肿瘤模型更加模拟体内肿瘤生长，使得APS联合铂类药物对体外抗癌结果更加具有[1]周彩存，王洁，王宝成，等.中国非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂治疗专家共识(2020年版)[J].中国肺癌杂志，2021,24(4):217.[2]NagasakaM,GadgeelSnon-smallcelllungcancer[J].Expertreviewofantican[3]RenY,LiS,SongZ,etal.Theregulatoryrolesphytochemicalsinliverdiseases[J].Nutrients,2022,14(11):2303.[4]PandyaU,DhuldhajU,SahayNS.Bioactivemushroompolysaccharidesasantitumor:anoverview[J].Naturalproductresearch,2019,33(18):2668-2680.[5]LiW,SongK,WangS,etal.AnC,2019,98:685-695.[6]ZhengY,RenW,ZhangL,etal.AreviewofthepharmacologicalactionofAstragaluspolysaccharide[J].FrontiersinPharmacology,2020,11:349.[7]SunCY,ZhangQY,ZhengGJ,cancercellstocisplatin[J].Biomedic[8]QiL,LuoQ,ZhangY,etal.Advancesintoxicologicalresearchofthcisplatin[J].Chemicalresearchintoxicology,2019,32(8):1469-1486.[9]WangL,ZhaoX,FuJ,etal.TheroleoftumourmetabolismFrontiersinmolecularbiosciences,2021,8:691795.[10]曲萌.自噬性细胞死亡在顺铂与ATR抑制剂联合所致有丝分裂灾难中的作用研[11]liYangY,wenLinZ,tingHeP,etal.InhibitoryeffectofAstragalusPolysacchari[J].BiologicalandPharmaceuticalBu[12]方星辰，牛俊博，汲晨锋.基于天然多糖构建纳米药物递送系统的研究进展[J].中[13]deVisserKE,JoyceJA.Theevolvingtumormicroenvironment:Frtometastaticoutgrowth[J].CancerCell,2023,41(3):374-403.[15]KechagiaJZ,IvaskaJ,Roca-CusachsP.Integrinsasmicroenvironment[J].NatureReviewsMolecula[16]JungJ,SeolHS,ChangS.Thegenerationandapplicationofpatient-derivedxmodelforcancerresearch[J].Cancerresearchandtreatment:officialjournalofKoreanCancerAssociation,2018,50(1):1-10.[17]张宁.仿生细胞外基质微环境的构建及对细胞行为的调控和应用[D].东南大学，2018,19(6):1764-1782.engineeringtissueandorgan-specificmicroenvironmentstrendsandemergingstrategiesintissueen[21]ChakrabortyJ,RoyS,GhoshS.Regulationofdecellularizedmaresponse[J].Biomaterialsscience,2020,8(5):1194-1215.[22]DeshpandeNU,JayakannanM.Cisplatin-stitchedpolysasynergisticcancertherapyoftripleantagonisticdrugs[J].Biomacromolecules,2017,18(1sensitivity/resistancetocisplatinchemotherapy:roleofmicro[J].Cellularsignalling,2021,78:109871.(五)创新点与项目特色(1)通过体外考察APS协同顺铂对肺癌细胞株的抑制作用，APS可以多靶点作用，参与整体调控，具有改善或逆转耐药的优势，通过使用中草药APS来减轻顺铂造成的各类毒性，提高抗癌活性。(3)着眼于基础到转化研究，通过体外3D肺癌肺转移工程化模型评估APS协同顺铂抑制肺癌生长的作用及机制，为APS用于临床化疗辅助治疗提供实验基础和理论依据。本项目总体技术路线如图5所示：APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用及机制细胞是否有抑制作用结构成分分析材料投入比例巨噬细<脱细胞肺基质dECM/明胶复合支架的制备dECM/明胶溶液交联后冻干成型性是否满足要求生长作用机制APS抑制肺癌细胞生长的作用机制肺癌细胞接种质结构及力学性能确定最优比例的dECM/明胶复合支架养肺癌细胞生长作用3D工程化肺癌模型构建及细胞行为分析顺铂APS协同顺铂抑制体外三维工程化肺癌发(定植生长及迁移)的作用及机制蛋白的调节机制分析图5.本项目总体技术路线之一。3D肺癌组织工程模型探究APS联合化疗药物减毒增效的抗肿效果及其作用机制，为APS辅助肺癌临床治疗提供实验基础是本项目要解决的另一关键问题。(3)预期成果代物。同时，我们希望利用此3D工程化肿瘤模型探究APS协同顺铂体外抑制肺癌生长转移的作用及机制，为APS临床用于肺癌辅助治疗提供更多实验依据；为APS在肺癌们也希望此模型用于评估其它临床前抗肺癌药物的治疗效果。具体成果预期有如下几末，减少批次差异性，最大限度降低因APS结构及组成的不同对后续其生物活性的影(2)保证高脱细胞效率前提下，减小猪源性肺组织基质成分的损失，制备尽可能保行为及对化疗药物敏感性等证明组织工程3D肿瘤模型用于研究肺癌生物学行为及作为(4)通过3D肿瘤模型探究APS协同顺铂抑制肺癌生长及转移作用及机制，明确APS提高化疗药物疗效，为APS辅助肺癌临床治疗提供更多实验基础和理论依据。期刊或核心期刊发表论文1篇，申请国家发明专利1项。(七)项目研究进度安排量、纯度、微观结构、分子量及单糖组成等理化性质的检测手段；熟悉APS在抗肿瘤用效果，确定合适的脱细胞方案，制备脱细胞肺基质/明胶支架并对其微观结构、支架孔径、孔隙率、吸水率、机械性能等进行多种物理性能检测解顺铂耐药和多器官毒性背后的分子机制，联合中药成分APS减轻其毒性，充分发挥死活染色、CCK、免疫荧光等检测手段考察细胞在支架粘附、渗透、活性、生长增殖情况，评估复合支架的生物相容性及构建的肿瘤模型作为药物筛选平台的可行性，总染色、常规组织学检测等手段考察APS协同顺铂对三维培养的肺癌A549细胞生长与转移的影响，并考察其抑制机制。探究APS协同化疗药物抑制体外3D培养工程化模型中(八)已有基础项目成员由1名指导教师、1名大三、1名大二及2名大一学生组成，均从属于生命科学与技术学院，涉及生物技术、生物制药及生物医学工程专业。(1)学生方面：学开具备一定的专业基础知识和科学思维能力。同时，自入学析问题和解决问题的能力，以上均为本项目(2)指导教师方面：指导教师近年来从事干细胞与组织工程、生物材料和抗肿瘤等目指导教师主持国家自然科学基金青年基金1项，主持山东省青创团队项目1项和山东省青年基金1项，主持潍坊医学院博士基金项目1项，参与2项国家科学自然基金面上|前期实验中已经制备过猪源性脱细胞肺基质dECM且考察单纯肺基质的生物相容性及细胞在支架的分布及渗透情况。结果发现，癌细胞在dECM培养第3天，细胞之间相互连接且增殖形成肿瘤球。第7天，支架表面及内部肿瘤球随处可见。第14天，肿瘤球尺寸明显增大，且与周围肿瘤球进一步相连。培养至21天，由于与相邻集落的相孔壁(橙色箭头)及骨架(蓝色箭头)上的粘附和伸展(图6B)。构建物的Hoechst染色像进行不同程度旋转呈现了细胞在支架的分布(图6B,I-II)。A标记死细胞数逐渐增多且呈剂量和时间依赖性。1FU作用后细胞内5-FU处理组肿瘤球数量和尺寸低于未加药组。加药5天后，CM实验组仍能观察到很多胞活率分别是83.46±2.6%和79.04±2.43%。然而，5-FU作用3天后细胞活率明显降低。加药5天后，尽管CM进一步抑制细胞生长，但是其作用效果明显低于5-FU组(图7B)。05-A5A5给药后细胞Bax蛋白表达水平明显升高。相比未处理组，实验组细胞F-actin表达并没有明显区别，但是5-FU给药后F-actin荧光强度显著下调。此外，DAPI染色结果发现CM(1000μg/mLAPS)和5-FU给药3天后，部分细胞出现从支架脱落的现象。APS(1000μg/mL)介导CM组细胞内Bcl-2蛋白表达略微下调，但是5-Bcl-2表达显著下降(P<0.05)。CM和5-FU干预后细胞内Bax表达明显升高(图8C)。统计学分析表明，给药处理2天时，CM组虽然提高Bax/Bcl-2的并无显著性差异。加药处理4天后，CM组Bax/Bcl-2的比值显著提高(P<0.05),但其比值仍明显低于5-FU作用组(图8D)。CC22图8.APS介导巨噬细胞上清促进细胞凋亡机制备，已装备倒置和正置荧光显微镜、CCD摄像装置以及Imageplus图象分析软件、红流式细胞仪、动物活体化学发光和荧光成像系统、DNA/RNA合成仪、数码凝胶图器。另外，学校具有丰富的国内外纸质版和电子版文献资料，方便项目成员进行查阅，无。开支科目预算经费(元)主要用途阶段下达经费计划(元)前半阶段用于项目所需试剂、1.业务费测试费和版面费(1)计算、分析、测试费用于激光共聚焦显微镜和SEM测试费(2)能源动力费(3)会议、差旅费(4)文献检索费(5)论文出版费论文版面费2.仪器设备购置费3.实验装置试制费4.材料费模型及生物学检测所需的耗材及试剂学校批准经费本项目利用体外3D工程化肺癌模型探究黄芪多糖协同化疗药物顺铂发挥抗导和支持，确保项目的顺利完成。导师(签章):203年5月了日同意年月日山东省高等学校国家级大学生创新创业训练计划项目项目编号项目名称APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用XX项目级别国家级(√)按计划进行、()进度提前、()进度滞后(起止时间)项目研究成果(已取得的成果)项目成果名称中药单体抗肿瘤应用基础与临床前景论文(在投)2论文(在投)二、项目季度报告(项目执行的进展情况，取得了哪些成绩，是否达到预期效果，以及在项目的开展过程中还存在哪些问题。)本项目执行开始日期为2023年7月，项目持续时间为2023.07-2024.0过去3个月，目前在进行支架的制备以及对支架形态进复合支架的制备材料。具体的技术路线图呈现如下：APS20请的p.德是两有同卜四成分分析E加的基即JECW30工程化弱焰横型构调盟交联及各No(定植生长及迁移)的作用及机制满APS协同睡的制体外30工程化所事生长及转移的作用及机AP5的高及那船细田(定植生长及迁移)的作用及机否结束制脚应妇的是否有和制用e2长的作性长作用前期预实验尝试过脱细胞肺基质/明胶复合支架的制备，实验结果并不理想，因而对实验方案及技术路线进行了调整。目前正在进行的部分具体过程及结果如下：第一批支架的制备：使用聚乙二醇、丝胶蛋白、壳聚糖三种材料进行复合支架的制备：壳聚糖(CS)聚乙二醇(PEG)丝胶蛋白(SS)总浓度按照上述浓度配置50ml体系的溶液，分别称取相应质量的药品，先将称取好的丝胶蛋白、后充分搅拌溶解。搅拌溶解后，取出转子，进行超声除泡，该步骤循环两到三次，待气泡充分从溶液中挥发出来后，用小药匙或者移液枪将气泡除去。最后将溶液进行加板，分别在24孔板上做好标记，将除泡后的混合溶液加入到孔板中，注意加入过程中不能出现气泡。加板完成干燥后所得支架如图3A所示，第一组支架从孔板中取出时发现支架出现明显的掉屑的现象(图3B),说明该组支架的药品浓度或配比不适宜。对三组支架切下上下表面加入交联剂进行交联浴锅中贴上封口膜进行搅拌溶解所得混合溶液为交联剂。随后将支架加入交联剂后室温交联12h。交联12h后对支架进行水洗，将三组支架分别放入水中后，观察到前两组的支架出现部分溶解的现象(图3C)。说明这两组支架配比或浓度不适宜。第三组支架形态完好，因而对其进行水洗(图3D),将该组支架放置于调速多用振荡器上，将转速设置为130并在此转速下震荡30min,以便充分洗去支架中的交联剂。之后将支架再次预冻12h后，冷冻干燥24h,得到最终的支架。第二批支架的制备：使用明胶和丝胶蛋白进行支架的制备：丝胶蛋白(SS)明胶(Gel)通过上述步骤对支架进行制备。一次冷冻干燥后，5%和6%复合支架均出现中空现象，4%复合支架部分出现中空，部分形态保持良好，因而只对4%复合支架中形态完好的支架进行后续处理。用刀片小心切除支架上表面后使用交联剂进行交联，结果观察到支架形态发生明显变结果可观察到支架部分凹陷且断裂严重，经过查找文献得知，明胶和丝胶蛋白具有强亲水性，支架材料中缺少非亲水性的材料且原本的交联试剂作用效果并不理想，从而导致支架形态无法维持，出现中部裂开的现象。第三批支架的制备：通过总结前两批支架出现的问题结合文献的查阅，改用海藻酸钠、明胶、丝胶蛋白作为复合支架的制备材料。明胶(Gel)海藻酸钠(SA)丝胶蛋白(SS)按照上述浓度配置50ml体系的混合溶液，分别称取相应的药品(图7A),将称取好的药品加入37℃水浴锅中搅拌溶解。待药品完全溶解后对混合溶液进行超声除泡(图7B)。由于混合溶液过于粘稠，将液体除泡之后放在37℃水浴锅中进行慢速旋转过夜处理(图7C),以便使混合溶液中的气泡充分排出。溶液气泡完全排出后将混合溶液进行加板，加入24孔板后，进行预冻和冷冻干燥处理，最终得到支架如图8。由图可以看出，所制备的海藻酸钠/明胶/丝胶蛋白支架为微黄色多孔结构，三个比例的支架宏观无明显区别。之后将加入氯化钙和EDCNHS进行交联及二次冻干处理，考察此次制备的复合支架方案是否可行。如果满足实验需求，将进一步对复合支架进行孔隙率、吸水率、微观结构、红外、机械强度等物理性能的考察。同时，对复合支架进行体内外生物相容性的检测。图8.Gel/SA/SS复合支架一次冻干后形貌已使用项目研究经费：2500元已报销金额：1500_元未报销金额：1000元项目经费开支情况备注论文版面费专利申请费调研、差旅费打印、复印费相关文件打印资料费试剂等耗材费其它五、指导教师意见：(包括项目的组织实施、进度、预期效果、经费使用等情况)2023年11月28日季度检查结果类别限期整改不合格潍坊医学院项目编APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用及机制XX项目级别国家级项目进展情况(√)按计划进行、()进度提前、()进度滞后主要研究阶段(起止时间)研究内容完成情况制备工程化肺癌模型中ECM替代物完成项目研究成果(已取得的成果)序号项目成果名称成果形式1中药单体抗肿瘤应用基础与临床前景论文(在投)2论文(在投)二、项目中期报告(项目执行的进展情况，取得了哪些成绩，是否达到预期效果，以及在项目的开展过程中还存在哪些问题，3000字以内)本项目执行开始日期为2023.07,项目持续时间为2023.07-2024.07,为期1年，目前过去一半时间，已经完成了前期复合支架的制备、支架相关的物理性能检测以及HE染色评估A549结构明胶/海藻明胶/海藻养肺癌细胞生长作用细胞上清CM细胞是否有抑制作用肺癌细胞生长作用机制用机制巨噬细的制备及EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(接),癌)EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(种),细)EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(肺),胞) 材料投入比例 明胶/海藻酸钠/丝胶蛋白溶液交联后冻干比例的明胶/海藻酸钠/是否满意Yes结束图1.本项目总体技术路线及已完成部分通过总结前期对支架制备过程中出现的问题以及查阅文献，最后选取了海藻酸钠、明胶、和力学性能检测等。具体过程及结果如下：1.复合支架的制备称取三组质量分别为0.25g、0.5g、0.75g的丝胶蛋白，三组质量为0质量为1g的海藻酸钠，加入到50mL纯水中，加入转子，放入40℃水浴锅中并持续搅拌，使其完全溶解，制备成丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠混合溶液。取出转子，将混合溶液置于超声机中超声3次，每次20min,以便使混合溶液中的气泡溢出。每次超声后用移液枪吸去混合溶液中漂浮在表面的气泡，超声后在搅拌器上慢速搅拌过夜保证去除所有气24孔板中并置于-20℃冰箱中预冻过夜后，将其放入冷冻干燥机(冷井温度：-80℃)中干燥28h,获得总浓度为3.5%、4%、4.5%的丝胶蛋白-明胶-海藻酸钠复合支架。经过干燥后的复合支架肉眼观察为淡黄色多孔结构，且随着浓度增大，孔愈发致密。将孔板内的支架取出，用刀片尽量薄的切去比较粗糙的两面。先向每个的氯化钙(氯化钙与海藻酸钠浓度比为1:1)溶液静置交联3h后，吸去每个孔内的氯化钙溶液，然后根据支架数量确定所需交联剂的总体积，配置100mL乙醇浓度为80%的交联剂。取一个烧杯，加入乙醇和水，将称量好的EDC、NHS、MES依次缓慢加入，加入转子，放入搅拌器中在37℃的条件下搅拌均匀。混匀后，向每个孔中加入2mL80%乙醇溶解的EDC(1-(3-二药品物质的量浓度c为50mmol/L,m=n*M=c*v*M。静置交联12h,吸去交联剂。随后对复合支架进行水洗。分别将三组浓度的复合支架转移至300mL烧杯中，放入震荡机中，用纯水清洗30min。将清洗后的复合支架放入4℃的冰箱中预冻12h后，再放入冷冻干C2.复合支架的物理性能检测将干燥后丝胶蛋白浓度分别为0.5%、1%和1.5%复合支架切成薄片(6*6*1mm),置于倒置显微镜下观察支架的微观形貌。进一步地利用ImageJ软件对每组支架进行孔径分度为1%时，支架孔径在201.1±7.1lμm左右，丝胶蛋白浓度为2%时，支架孔径约为 0图3.复合支架的孔径检测2.2.丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠复合支架吸水率检测将干燥的复合支架切成长方体结构，尽量使各试支架的干重，用m1表示，置于24孔板中，加入PBS溶液室温浸泡3h后纸将支架表面的水进行擦拭，称取其重量记录为m2。每种材料测试多组取角平整。称量复合边,平均值作为实验结 0图4.复合支架的吸水率检测支架的吸水能力对细胞输送营养物质和代谢物至关重要。图4为不同浓是由于复合支架中2.3.丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠复合支架力学性能检测将干燥后的支架切成长方体，确保表面高度整齐，使用万能材料试验机对复合支架的力学架变形量与总长度的比值，ε=(l-x)/l;其中y为压力负荷，单位为N;a,b,1分别为支架的长、 0图5.复合支架力学性能检测3.HE染色评估A549细胞增殖及其形态待复苏后的A549细胞在培养瓶中达到90%的融合后，加入胰酶进行消化后，1000rpm离心5min,倒掉上清液，加入1mL完全培养基吹打混匀后，进行血球计数板计数，经过适当浓度稀释后，取50μL细胞悬浮液(2×10³个)加入24孔板中培养5天，通过HE染色考察细HE分析：待A549细胞在孔板分别培养1d,3d和5d后，将培养基吸出，加入4%多聚甲醛固定15min后，用PBS冲洗2次。之后，加入200μL苏木精染液染色20min,PBS洗去浮色。加入分化液分化10s,PBS浸洗2次。加入200μL伊红染液染色2min,PBS清洗2次后，由HE染色结果可知，培养一天后，细胞均已粘附于孔板底部，细胞良好伸展，多数细胞为鳞状，细胞方向各异(图6)。放大倍数下，HE的细胞核清晰可见，细胞呈现良好的铺展。角形或多角形。随着培养时间的延长，细胞不断增殖，细胞密度增多，待细胞培养5天后，细胞之间相互连接，此时细胞已经在孔板达到90%以上融合，HE染色显示有些区域细胞方向错以上结果明确了1%复合支架可以作为后期体外三维肺癌模型的支架材料，其在成分、孔作用。目前实验开展顺利，较好的达到了预的多种细胞生物学行为(粘附、分布、形态、渗透、活性、增殖等)并利用3D工程化肿瘤模型初步探究APS协同顺铂对肺癌生长及转移的作用及机制。已使用项目研究经费：4800元项目经费开支情况用途金额备注论文版面费专利申请费调研、差旅费打印、复印费资料费试剂等耗材费用于购买细胞、支架材料及生物学检测所需的耗材及试剂硬件购置费其它肺癌细胞在复合支架中多种细胞行为的检测(粘附、分布、形态、渗透、活性、增殖等),复合支架生物相容性实验研究及利用3D工程化肿瘤模型初步探究APS协同顺铂对肺癌生长及转移的作用及机制。该项目实施方案设计合理，实验进度按照前期安排稳定进行，且取得了较好经费使用合理，项目组成员团队合作能力较好，实验同意√限期整改山东第二医科大学APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用及机制XX项目级别国家级项目进展情况主要研究阶段(起止时间)研究内容完成情况构建体外肺癌模型并考察肺癌细胞多种生物学行为完成项目研究成果(已取得的成果)序号项目成果名称成果形式1山东省大学生医药生物技术技能大赛(创新大赛)-山东省一等奖竞赛获奖2竞赛获奖的开展过程中还存在哪些问题。)本项目执行开始日期为2023.07,项目持续时间为2023.07-2024.07,为期1年，目前已经制备了丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠复合支架，并对其进行了多项物理性能，进一步地接种肺癌细胞构建3D肺癌模型并确定其可行后，加入APS和顺铂考察药物抑制肺癌细胞的作用。具体这几个月的实验及其结果展开如下：将复合支架切成薄片后浸于75%乙醇溶液中并放置在紫外灯下灭菌过夜。将灭菌好的支架从六孔板中取出，用PBS清洗两遍以洗去残留的酒精，随后将支架放入24孔板内，并将24孔板置于超净台内开启吹风至支架三分之二干燥。将肺癌细胞A549用PBS清洗2次后，加入2mL胰酶进行消化，之后加入4mL完全培养基终止消化，将消化下的细胞转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min。对离心后的细胞进行重悬，将细胞悬浮液加入到2mLEP管中，吹打均匀后，吸取100μL滴入血球计数板中，用显微镜对计数板计数区进行计数。计数完成补加100μL培养基，37℃培养箱孵育4h后，每孔补加1mL培养基至液体基本覆盖每孔的底将A549细胞接种到1%的丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠复合支架上培养1d、3d、5d和7d后，使用Calcein-AM染色和HE组织学分析评估细胞在支架的增殖。将A549细胞接种到1%丝胶箱中孵育30min后，置于激光共聚焦下拍照，使用激光共聚焦序列扫描考察肺癌细胞在复合多个肿瘤球后，加入以上不同浓度的药物进行处理，待培养2天后，移去原培养基和药物，每入37℃培养箱中孵育30min后，使用PBS溶液冲洗2次后，置于激光共聚焦下拍照，考察不同给药处理对3D肺癌细胞生长的抑制效果。待肺癌模型构建成功，加入上述不同给药组进行孵育48h后，PBS冲洗3次，2.5%戊二醛固定3h,加入梯度酒精(50%,70%,90%,100%)逐级脱水，每次脱水30min,室温下自然干燥后，用导电胶将细胞-支架构建物粘于载物台进行喷金60s,置于钨灯丝扫描电镜下拍照，通过给药后细胞形态的变化考察APS-CM及每孔加入20μLCCK-8和200μL基培混合液，在培养箱孵育3h后，使用移液枪吹打细胞-支架复合物，每孔吸取100μL混合液至96孔板中，于酶标仪450nm处检测每个孔的吸光度OD值，通过每组的OD值和存活率评估不同给药处理对3D肺癌细胞生长的抑制效果。2.实验结果2.1肺癌细胞在丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠复合支架的生长增殖钙黄绿素和HE切片结果显示细胞接种1天后，绝大部分细胞在复合支架骨架及表面贴壁且铺展；培养3天后，细胞沿支架骨架及孔隙呈良好伸展，支架结构清晰可见，随着培养时间延长，到第5天的时候，大部分细胞开始收缩且细胞间堆叠形成大小不一的集落，细胞间连接非常紧密；培养7天后，细胞集落进一步增大，遍布整个复合支架(图1)。随着培养时间延长，细胞逐渐生长增殖且绝大多数活细胞被钙黄绿素染色呈现强绿色荧光均表明支架良好的生物相容性，且支架具有较好的多孔结构，利于营养物质及代谢废物传质的进行，为细胞生长提供了良好的增殖空间。2.2APS协同顺铂对三维肺癌细胞的抑制作用死活染色结果如图2所示，空白对照组在支架形成了多个细胞集落且连接成片，绝大部分活在支架的分布。经给药处理肝癌细胞2d后，不同给药组均表现出不同程度的杀伤作用，钙黄绿素荧光标记的活细胞数逐渐减少，被PI染成红色的坏死细胞数逐渐增多。另外，从Hoechst染色也可看出APS和顺铂单独作用组的细胞毒性作用弱于两者的协同效果，联合给药组多数细胞集落逐渐松散且外层细胞逐渐溶解，细胞集落数量明显减少，多数细胞处于凋亡状态，被PI着色，仅有少量状态不佳的小细胞集落及细胞残片。以上结果表明APS和顺铂均具有细胞毒作用，两者协同ControlSEM观察APS介导巨噬细胞上清CM和顺铂对3D肝癌细胞生长的抑制作用(图3A)。给药第2天，空白对照组能清楚看到紧密堆叠密的细胞集落，集落之间相互连接成片，细胞状态良好。单独的APS和顺铂组的外层细胞形态均发生一定改变，部分出现凋亡小体现象(蓝色箭头),且相比未处理组细胞集落尺寸明显减小(橙色虚框)。联合给药组细胞集落逐渐分CCK-8定量考察单独APS、顺铂及两者联合给药对3D肝癌细胞的作用效果(图2B-C)。给药处理一天后，APS单独给药和顺铂组细胞活性区别并不显著,细胞活率均高于85%以上。给药2天后，给药组细胞毒作用增强，细胞活率明显下降。加药3天后，尽管单独给药进一步抑制细胞生长，但是其作用效果明显低于联合给药组(p<0.001)。以上结果表明，APS介导AAControlAPS-100B图3.APS和顺铂对三维肺癌细胞形态及生长的影响(C)APS和顺铂对肺癌细胞活率的影响已使用项目研究经费：21000元已报销金额：21000元项目经费开支情况用途备注论文版面费专利申请费调研、差旅费打印、复印费资料费试剂等耗材费其它四、项目后期具体工作计划项目已完成同意季度检查结果类别限期整改生命科学技术学院APS协同顺铂抑制体外3D工程化肺癌生长及转移的作用及机制项目级别国家级项目起始时间：2023年7月计划完成时间：2024年6月实际完成时间：2024年6月项目负责人及成员姓名学号XX多糖生物活性检测及姚伟杰生物学实验及数据分析冯子慧支架性能检测及3D模型构建高晓晨多糖活性检测姓名XX副教授项目指导与资助讲师项目指导一、项目实施情况(请就研究目标、研究过程、研究成果、研以内):(1)考察APS和顺铂物理化学及结构，结合已有文献，确定其生物活性发挥的可能因素；考察APS是否具有直接抗肺癌活性。(2)分别制备脱细胞猪肺基质dECM及dECM/明胶复合支架，对支架表观形貌、结构及组成、孔隙率、吸水率、机械性能及热稳定性等物理性能进行表征；接种肺癌细胞并考察支架上细胞分布、渗透、生长增殖情况以评估构建模型的可行性，考察3D模型相比2D肿瘤模型药物筛选的准确性。(3)利用3D工程化肿瘤模型初步探究APS协同顺铂对肺癌生长及转移的作用及机制，为APS在动物体内发挥减毒增效作用提供实验依据，从而为APS临床应用于肺癌患者(1)APS协同顺铂对2D肺癌细胞生长的影响(a)查阅文献及预实验确定APS的最佳浓度范围，通过SEM、活死染色、CCK及DAPI(b)考察APS联合顺铂两药对肺癌A549细胞的增殖抑制作用的关系，通过检测考察APS作用后细胞周期的变化，顺铂作用后细胞周期的变化，还有两药的联合出现细胞周期的变并对支架形态进行观察、对支架进行机械强度测试。但制备出的复合支架在用镊子夹取时后改用明胶和丝胶蛋白，但由于这两种支架材料的亲水性过强，导致原本选用的交联试剂达不到理想的交联效果，制备出的支架冻干成型性和机械强度都不理想；经过查阅文献和多次实验，确定制备方案为：使用丝胶蛋白(0.5%、1%、1.5%)、海藻酸钠(2%)、明胶(1%)作为复合支架的制备材料。.孔径大小、吸水率等的影响，界定最优的冷冻干燥参数。通过探究不同交联剂对复合支架生物力学性能);初步确定复合支架的细胞及组织生物相容性，具体包括肺癌细胞在复合(3)APS协同顺铂抑制3D培养肺癌生长的作用及机制(a)通过试验设计确定肺癌细胞-脱细胞基质肿瘤模型用于研究药物作用的适宜细胞密度及APS、顺铂体外作用肺癌细胞的适宜浓度；对比无APS干预组，从其对免疫细胞及其细胞周期的阻滞层面探究APS协同顺铂抑制肺癌细胞生长及转移的相关机制。(b)明确APS、顺铂浓度及细胞合适的接种量后，构建肿瘤模型。通过活死染色、CCK、SEM、DAPI染色、AV/PI试剂盒、常规组织学检测等手段考察APS联合顺铂对三维培养的肺癌A549细胞生长的影响，并考察其抑包括干扰细胞周期和促进细胞凋亡等方面。观察APS联合顺铂对肺癌A549细胞细采用氯化钙离子交联和EDC/NHS共价交联并二次冷冻干燥后得钠/明胶复合支架呈现多孔联通结构，0.5%和1%复合支架大孔套小孔复合支架的孔(图1A)。随着丝胶蛋白浓度的提高，复合支架孔径逐渐减少，支架总体的孔径均在170-280μm之间(图1B)。支架的吸水能力对细胞输送营养物质和代谢物至关重复合支架的压缩模量逐渐增大，且各组均具有显著性差异(图1D)。所制备的丝胶蛋白/明胶/海藻酸钠复合支架具有良好的力学性能，能够支持后续细胞的生长增CBD图1.丝胶蛋白/海藻酸钠/明胶复合支架的物理性能分析(A)通过SEM考察复合支架的微观结构；(B)复合支架的孔径分析；(C)复合支架的吸水率检测；(D钙黄绿素和HE切片结果显示