仪器分析化学-第一章-色谱基本理论

仪器分析化学第一章色谱基本理论

长白落叶松LarixolgensisHenryvar.koreanaNakai是松科落叶松属植物，落叶乔木，叶在长枝上螺旋状散生，在短枝上簇生，倒披针状条形，长1~2.5厘米。雌雄同株，球花单生短枝顶端，球果幼时淡红紫色，熟后为淡褐色或褐色。树皮褐色，含鞣质。松树皮提取物被广泛用作食品添加剂和保健品出售或出口，国外已有用松树皮提取物开发的药品上市。药理活性研究表明，松树皮提取物在抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、保护心血管及改善微循环等方面具有广泛的生物活性。长白落叶松分布于中国吉林长白山区和黑龙江牡丹江流域。在林场其树皮常被当作废弃物处理。在此之前，还未有对该松树皮的化学成分进行过系统研究的报道，因此，无论从基础研究还是从应用开发的角度考虑，都有必要对长白落叶松树皮的化学成分进行系统深入的研究，进而寻找其中的活性成分桂花的花芽分化基本过程可以分为花序分化期、小花分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊（退化雌蕊）分化期等6个时期。四季桂具有多次开花的现象，秋季（与秋桂同期）的花芽分化和开花特性与其他季节的开花特性明显不同，秋季的花芽分化和开花特性与秋桂基本一致。在杭州地区,，大部分秋桂品种从6月上旬开始进入花芽分化，8月底到9月初完成,，历时近3个月。不同品种花芽分化进程略有不同主要是由于品种自身营养积累状况和对气温的敏感性不同造成；花芽分化对气温、相对湿度等环境条件没有特殊要求，但相对低温能显著促进花芽分化。不同性别的品种花芽分化存在一定的差异，要表现在雌蕊（退化雌蕊）的分化和发育上：无论是雄性品种还是两性品种,，分化前期即从花序分化期到雄蕊分化期均表现为两性状态,，之间无显著差异,，蕊分化期才表现出显著的不同仪器分析化学第一章色谱基本理论仪器分析化学第一章色谱基本理论长白落叶松LarixolgensisHenryvar.koreanaNakai是松科落叶松属植物，落叶乔木，叶在长枝上螺旋状散生，在短枝上簇生，倒披针状条形，长1~2.5厘米。雌雄同株，球花单生短枝顶端，球果幼时淡红紫色，熟后为淡褐色或褐色。树皮褐色，含鞣质。松树皮提取物被广泛用作食品添加剂和保健品出售或出口，国外已有用松树皮提取物开发的药品上市。药理活性研究表明，松树皮提取物在抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、保护心血管及改善微循环等方面具有广泛的生物活性。长白落叶松分布于中国吉林长白山区和黑龙江牡丹江流域。在林场其树皮常被当作废弃物处理。在此之前，还未有对该松树皮的化学成分进行过系统研究的报道，因此，无论从基础研究还是从应用开发的角度考虑，都有必要对长白落叶松树皮的化学成分进行系统深入的研究，进而寻找其中的活性成分桂花的花芽分化基本过程可以分为花序分化期、小花分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊（退化雌蕊）分化期等6个时期。四季桂具有多次开花的现象，秋季（与秋桂同期）的花芽分化和开花特性与其他季节的开花特性明显不同，秋季的花芽分化和开花特性与秋桂基本一致。在杭州地区,，大部分秋桂品种从6月上旬开始进入花芽分化，8月底到9月初完成,，历时近3个月。不同品种花芽分化进程略有不同主要是由于品种自身营养积累状况和对气温的敏感性不同造成；花芽分化对气温、相对湿度等环境条件没有特殊要求，但相对低温能显著促进花芽分化。不同性别的品种花芽分化存在一定的差异，要表现在雌蕊（退化雌蕊）的分化和发育上：无论是雄性品种还是两性品种,，分化前期即从花序分化期到雄蕊分化期均表现为两性状态,，之间无显著差异,，蕊分化期才表现出显著的不同（二）基线（baseline）1、基线（baseline）在正常操作条件下，仅有流动相通过时响应信号－时间曲线。2、基线噪声（baselinenoise）由各种因素所引起的基线波动。(一般计算峰前后1-2min内的噪声）3、基线漂移（baselinedrift）基线随时间定向的缓慢移动（三）色谱峰（chromatographicpeak）1、正常色谱峰：呈正态分布2.拖尾峰（tailingpeak）：前沿陡峭，后沿拖尾的不对称色谱峰3、前伸峰（leadingpeak）:前沿平缓，后沿陡峭的不对称色谱峰5.假峰（ghostpeak）又称鬼峰：由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。色谱峰：1个样品组分的色谱峰可用3个参数来描述，即峰高(或峰面积)、峰位和峰宽。峰高(或峰面积)用于定量；峰位用于定性；峰宽可用于衡量柱效。若描述一组色谱峰，还需用分离参数表述相邻峰的重叠程度。二、保留值－定性参数（一）保留时间(retentiontime)（1）死时间(deadtime):tM（2）保留时间(retentiontime)（tR）（3）调整保留时间(adjustedretentiontime)（tR

＇）：tR＇=tR－tM（二）保留体积(retentionvolume)（1）死体积（VM）：VM=tM×Fc（2）保留体积（VR）：VR=tR×Fc（3）调整保留体积(VR＇)：V

R＇=VR－VM

Fc：载气流速（mL/min)（4）校正保留体积(VR0)：用压力梯度校正因子修正的保留体积：VR0=jVR（5）净保留体积(VN)：用压力梯度校正因子修正的调整保留体积(VN)=jV

R＇用压力梯度校正因子修正的调整保留体积（6）比保留体积（Vg）每克固定液校正到273K的净保留体积（三）相对保留值（选择性因子a）：相同操作条件下，两组分的调整保留值之比。r2，1=t´R2

/t´R1=V´R2/V´R1（四）保留指数(retentionindex）t’R(x)---待测物X的调整保留时间t’R(z)---碳原子数为Z的正构烷烃的调整保留时间t’R(z+n)---碳原子数为z+n的正构烷烃的调整保留时间t’R(z)≤t’R(x)≤t’R(z+n)（通常n=1）规定正构烷烃的I值是其原子数的100倍，如：正庚烷I=700－保留指数差化合物x在某一固定液s上测得的保留指数减去在角鲨烷（异三十烷）固定液上得到的保留指数。（一）.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差(

)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354

（3）峰底宽(W)：W=4

三、柱效参数从色谱图中，可得许多信息：

1色谱峰的个数，可推断所含组分的个数；2根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；3根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；4色谱峰的保留值及其区域宽度，评价柱效依据；5色谱峰两峰间的距离判断组分选择性

(一）.分配系数（partitionfactor）K

在一定温度、压力下，组分在固定相和流动相中平衡浓度的比值。Ms

ccK==组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度第三节色谱法基本原理一、分配系数和分配比：相平衡参数，是用来描述色谱过程中，样品组分在相对运动的两相中的分配情况动画分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。同一条件下，若两组分的K值相等，则色谱峰重合，差别越大，色谱峰的距离越大（二）.分配比（partionratio）k或K’

在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：

1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数决定于组分和两相性质,与两相体积无关.而分配比与组分和两相性质有关,也两相体积有关3.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

分配比也称：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；（三）分配比与分配系数的关系

式中β为相比。填充柱相比：5～35；毛细管柱的相比：50～1500。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；

VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同；气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量；（四）分配比与保留时间的关系

tR=tM(1+k)tR’=ktM（五）分配比、分配系数与选择性因子的关系

a=t´R（2）/t´R（1）=k2/k1=K2/K1讨论：如何使A、B组分完全分离ABAB组分A、B在沿柱移动时不同位置的浓度轮廓浓度1.两组分的分配系数必须有差异2.区域宽度的扩展速度应小于区域分离的速度3.在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱练习题1.混合样品a,b,c,d,e在柱上的分配系数分别为105，85，310，50，205，则各个组分流出柱的先后顺序为（）A

d，b，a，e，cB.c，d，a，b，eC.c，e，a，b，dD.a，b，c，d，e下列参数改变时，会引起分配系数变化的是…………（）A柱长增加B.固定相改变

C.相比减少D.流动相流速增加

色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；

塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。（5）所有物质在开始时全部进入零号塔板二、

塔板理论

（1）.塔板理论（platetheory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；组分在n=5,k,=1,m=1柱内任一板上分配表

色谱柱长：L，

虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!（2）.有效塔板数和有效塔板高度

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：（二）塔板数和塔板高度柱效：也叫柱效能理论塔板数n有效塔板数neff理论塔板高度HH=L/n有效塔板高度HeffHeff=L/neff得出色谱流出曲线方程：

C0:进样的浓度tR:保留时间σ:标准偏差较好地解析了色谱曲线形状2浓度极大点Cmax的位置是tR(即VR)3计算评价柱效塔板理论成功之处:塔板理论不足之处

不能解析载气流速u对N影响

不能指出板高H受那些因素影响（3）.塔板理论的理解(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。三.速率理论-影响柱效的因素（一）.范.弟姆特（VanDeemter）方程式－气相色谱速率理论

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？A─涡流扩散项（eddydiffusion）

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。（动画）B/u—分子扩散项

moleculardiffusion）

B=2νDgν

：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。（动画）

k为容量因子；Dg、DL为扩散系数;dp：固定相的平均颗粒直径;df

液膜的厚度。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，降低固定相液膜厚度，可降低传质阻力。C·u—传质阻力项

传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：

C=（Cg+CL）（动画）（二）范氏方程讨论

1、颗粒大小与粒度范围

（1）颗粒太大，填充均匀性越差λ,（2）dP太小气阻大，固定相颗粒直径一般40—60，60—80，80—100目。

A=2λdp

2.载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速

，柱效

。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。(三）影响谱带变宽的其它因素1、非线性分配色谱2、载体表面活性吸附中心造成的拖尾峰3、柱外效应当溶质浓度较低时，K为常数，Cs与Cm成线性关系，其相应的色谱过程称为线性色谱。CSCM1、非线性分配色谱CMCSCSCM非线性色谱。其具有以下几个特点：a、溶质洗脱峰不再是对称的正态分布，而是有“拖尾”或“伸舌”现象；b、样品的保留值可变。线性色谱中同一样品的保留值是常数，只随样品不同而变化；c、色谱峰的峰高与浓度不是线性关系。在线性色谱中峰高与组分是线性关系。峰高是定量分析的重要数据。在非线性色谱中，峰高增加的速率随浓度的增加而逐渐降低，因而峰高不能作为定量分析的指标。（3）.气相色谱速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。（二）.Giddings方程式－液相色谱速率理论液相色谱与气相色谱的的主要区别在于液体和气体性质的差异参数气体液体扩散系数Dm/cm2.s-1密度ρ/g.cm-3粘度η/g(cm.s)-110-110-510-3110-410-21.涡流扩散项HeHe＝2λdp1958年，Giddings和Snyder等提出液相色谱速率方程式：2.纵向扩散项Hd3.传质阻力项(1)固定相传质阻力项(2)流动相传质阻力项(i)流动的流动相中的传质阻力项Hm(ii)滞留的流动相中的传质阻力项Hsm在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：

H=A+B/u+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。提高柱内填料装填的均匀性和降低粒度选用低粘度的流动相或适当提高柱温

4.柱外展宽(超柱效应)柱前展宽:主要是由进样引起的柱后展宽：主要是由连接管、检测器流通池体积所引起的在气一固色谱柱内，各组分的分离是基于组分在吸附剂上的_______________能力的不同，而在气一液色谱中，各组分的分离是基于各组分在固定液中__________能力的不同。

色谱峰越窄，理论塔板数就越_________，理论塔板高度就越______，柱效能就越_____。

一、分离度:评价分离情况的综合指标

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；

区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：第四节分离度与基本色谱分离方程式讨论：色谱分离中的四种情况的讨论：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。令W2=W1=W（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：二.色谱分离基本方程式色谱分离基本方程式柱效项柱容量项柱选择项1.分离度与柱效的关系提高分离度的方法:增加柱长,或降低理论板高注：对于一定理论板高的柱子2分离度与容量比的关系（容量因子）

1<k<10改变k的方法:改变柱温和相比3分离度与柱选择性的关系（选择因子）

增大α的最有效方法是选择合适的固定液。α太小，两组分未分开应改变固定相极性，降低柱温k太小，n也太小，应增大固定液用量，降低柱温n太小，许多组分未分开应设法降低板高，提高柱效如何根据具体情况优化分离已知任何两项，可求第三项4.分离度、柱效和选择性参数关系有效塔板表示的色谱基本方程：n与n有效关系：第五节色谱的定性与定量分析色谱法分离好,定性难色谱分析分三个阶段仪器调试操作条件选择定性定量---保留值定性---峰高,峰面积定量第一节定性方法一.保留值定性（一）气相色谱法的保留值定性1.利用纯物质对照定性该法是基于在一定操作条件下，各组分保留时间是一定值的原理。优点：简单缺点：要有纯样，适用于已知物，操作条件要稳定:流速、温度等具体做法：1）分别以试样和标准物进样分析——各自的色谱图；2）对照：如果试样中某峰的保留时间和标样中某峰重合，则可初步确定试样中含有该物质。3）也可通过在样品中加入标准物，看试样中哪个峰增加来确定。2.相对保留值定性用保留值定性要求两次进样条件完全一致，这是比较困难的。而用αi,s定性，则只要温度一定即可。优点：比绝对法重现性好(流速不影响）缺点：也需要纯样，比绝对法麻烦具体做法：在样品和标准品中分别加入同一种基准物

s，将样品的αi,s和标准物的αi,s相比较来确定样品中是否含有i组分。3.加入已知物增加峰高法

在未知样品加入纯样看哪个峰高增加的组分即可能为这种已知物。4.保留指数定性法该指数定性的重现性最佳。当固定液和柱温一定时，定性可不需要标准物。设正构烷烃的保留指数为碳数100。测定时，将碳数为n和n+1的正构烷烃加入到样品x中进行色谱分析，此时测得这三个物质的调整保留值有如下关系：优点：测得Ix值与文献值对照就可定性。缺点：1.要有正构烷烃纯样。2.可供查阅的文献值太少。3．柱子与柱温要与文献规定相同［例］乙酸正丁酯在阿皮松L柱上进行分析（柱温100℃）。由图中测得调整保留时间为：乙酸正丁酯310.0mm，正庚烷174.Omm，正辛烷373.4mm，求乙酸正下酯的保留指数解：已知n=7即乙酸正丁酯的保留指数为775.6。在与文献值对照时，一定要重视文献值的实验条件，如固定液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。5、其它方法定性1.用比保留体积Vg定性

优点：不用纯样缺点：如果固定液流失，则定性不准。2.利用保留值规律定性

a.碳数规律logVg=A1n+B1b.沸点规律logVg=A2Tb+B2c.柱温规律I=A3Tc+B3比保留体积（Vg）:每克固定液校正到273K的净保留体积(二）液相色谱中的保留值定性直接比较法增加峰高法（三）平板色谱中保留值定性比移值二.选择检测器定性

三.联用GC-MSGC-FTIR(傅立叶变换红外光谱)GC-NMR缺点：标准谱图太少，一般用计算机检索四．双柱定性：可克服在一根柱上，不同物质可能出现相同的保留时间的情况。一根极性柱，一根非极性柱。若二根柱上tR未知与tR已知都吻合，则定性可靠性就增一倍。

例：1－丁烯和异丁烯五利用化学反应配合色谱定性柱后流出物做官能团分析柱前反应配合气相色谱定性第二节定量分析分析是根据检测器对待测物的响应（峰高或峰面积）与待测物的量成正比的原理进行定量的。因此必须准确测定峰高h或峰面积A。

1.求峰面积定量准确度决定于2.求相对校正因子

3.选准确定量方法峰面积A和峰高h的测量：hh一.峰面积1.对称峰：A=1.065W1/2h2．不对称峰

A=1/2

h（W0.15+W0.85）

式中W0.15和

W0.85

分别为峰高0.15倍和0.85倍处的峰宽

二.定量校正因子由于检测器对不同物质的响应不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积。或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质的量。例如用TCD，N2作载气测O2，H2的百分含量若H2、O2峰面积相同,百分含量相同就不对。不能用下式计算：

∵H2的热导系数大,TCD响应大,但实际含量小∴必须用校正因子.

ACfH250050%0.1O25050%11）绝对校正因子f叫绝对校正因子,决定于检测器的灵敏度，f不易测定。∴常用相对校正因子f’

通常所指的校正因子都是指相对校正因子。2.

相对校正因子相对校正因子定义为即某组分i的相对校正因子f’为组分i与标准物质s的绝对校正因子之比。

相对校正因子的表示方法

重量校正因子与摩尔校正因子

）质量校正因子m--质量A--峰面积）摩尔校正因子M--分子量

准确定量分析时,应该用自己测定的校正因子,而不用文献值∵校正因子随检测器类别,使用载气的不同而不同相对校正因子的测定方法

f’值可引用文献值，也可以自己测定。标准物质，TCD是苯，FID是正庚烷。准确称量被测组分mi和标准组分ms的质量在线线范围内进样测Ai和As

求f’

m或f’

M

多次测定，求平均值。三.定量方法归一化法,内标法,外标法。各有其优缺点,1归一化法（normallizationmethod）优点:是相对法∴与进样量无关,定量较准确缺点:要求全出峰(样品所有组分都要出峰)

全知峰(有所有组分的标准品)

2.外标法(externalstandardmethod）标准曲线法)用待测组分的纯样制标准曲线优点：快速简单,只要待测组分出峰且完全分离即可缺点：绝对法,进样量,操作条件要不变

单点校正法适用条件：被测物中各浓度范围变化不大时。配制一个和被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样。Wi/Ws=Ai/As3.内标法不能全出峰或只需测某几个组分时采用方法:准确称取样品,加入一定量内标物,根据质量及峰面积求出某组分的含量ms

内标物质量；As

内标物峰面积;Ai

被测物峰面积;fs

内标物质量校正因子;fi

被测物质量校正因子m样品重一般选内标物为基准，fs=1步骤:a.选内标物

b.测fm(i/s)(fi)c.称未知样m.内标物ms,测Ai,As内标法的关键是选择合适的内标物，它必须符合下列条件：(1)是样品中原来不存在的纯物质，性质与被测物相近，能完全溶解于样品并且不与样品发生化学反应。（2）内标物的峰应尽量靠近被测组分的峰，或位于几个被测物之峰的中间并与这些色谱峰完全分离。（3）内标物的质量应与被测物质的质量接近，能保持色谱峰大小差不多。例:测甲苯,乙苯,正丙苯的混合物,苯作内标物求组分含量组分面积cm2

校正因子fm(i/s)苯4.001.00甲苯3.840.96乙苯1.950.92正丙苯0.820.90内标法优点:是相对法,不要求全出峰,全知峰缺点:要有内标物纯样,两次称重,比较麻烦ms/m=1/104.内标标准曲线法将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：wiAi

/As特点:不必测出校正因子,消除了某些操作条件的影响,不需严格定量进样四、定量分析误差的主要来源峰面积与定量因子测量精度样品的稳定性与代表性进样系统影响柱系统的影响气相色谱操作条件柱温、检测温度、载气流速检测器的影响1.某化合物只含有乙醇、正庚烷、苯和醋酸乙酯，用热导池检测器进行色谱分析数据如表3-1。计算各组分的百分含量。气相色谱分析二甲苯氧化母液含量，称取样品0.1250g,加入正壬烷内标0.0625g，间二甲苯的校正因子为0.96，正壬烷校正因子为1.02，间二甲苯的峰面积为3.5cm2，正壬烷的峰面积为12cm2求样品中间二甲苯的含量。用外标法分析某原料气中H2S与SO2的含量，用不同体积的纯气，以氮气配成不同浓度的标准气体，在选定的色谱条件下分析进样1ml，数据见下表。分析样品时，同样进1ml，这时H2S的峰高为13.5cm，SO2的峰高为0.75cm，求其百分含量。

R=1

分离程度达98%

R>=1.5

完全分离,达>=99.7

也叫基线分离

R<1

二峰明显重叠讨论：（1）分离度与柱效的关系（柱效因子）

提高分离度的方法:增加柱长,或降低板高（2）分离度与容量比的关系（容量因子）

1<k<10改变k的方法:改变固定相;改变柱温和相比(GC)改变流动相组成；改变固定相;改变柱温和相比(HPLC)（3）分离度与柱选择性的关系（选择因子）

增大α的最有效方法是选择合适的固定相。α太小，两组分未分开应改变固定相极性，降低柱温k太小，n也太小，应增大固定液用量，降低柱温n太小，许多组分未分开应设法降低板高，提高柱效（二）.Giddings方程式－液相色谱速率理论液相色谱与气相色谱的的主要区别在于液体和气体性质的差异参数气体液体扩散系数Dm/cm2.s-1密度ρ/g.cm-3粘度η/g(cm.s)-110-110-510-3110-410-21.涡流扩散项HeHe＝2λdp1958年，Giddings和Snyder等提出液相色谱速率方程式：2.纵向扩散项Hd3.传质阻力项(1)固定相传质阻力项(2)流动相传质阻力项(i)流动的流动相中的传质阻力项Hm(ii)滞留的流动相中的传质阻力项Hsm在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：

H=A+B/u+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。提高柱内填料装填的均匀性和降低粒度选用低粘度的流动相或适当提高柱温

4.柱外展宽(超柱效应)柱前展宽:主要是由进样引起的柱后展宽：主要是由连接管、检测器流通池体积所引起的第三节分离条件的选择要求1.两峰间有一定距离—tR不同要求2.峰宽要窄—W1/2要小提问:怎样制备一根好的色谱柱?怎样评价?怎样选色谱条件?一般:1.选择性(相对保留值α或保留指数I)－－评价固定液对物质的保留作用2.柱效能(n，neff)－－评价柱效能3.分离度R(总分离效能指标参数)分离度是将以上二者综合考虑既反映柱效能,又反映选择性

分离度分离条件的选择主要是提高“难分离物质对”的分离度（1）峰宽分离度R国家标准分离度

当两峰高相差不大,且峰型接近时可以认为W1=W2=W

(2)半峰宽分离度R1/2

R与R1/2关系,对于高斯R1/2=1.7R二，分离基本关系式此式用于计算达到一定R时所需的n

n表示柱效,难以说明真实分离效果α1.2表示选择性,表示固定液对组分保留作用,不说明柱效R是总分离效能指标,只有>1时,二组分才有可能分离α1.2讨论：

R=1

分离程度达98%

R>=1.5

完全分离,达>=99.7

也叫基线分离

R<1

二峰明显重叠分离度与柱效关系(R与n)所以我们希望用柱效高的色谱柱2.R与K，的关系

α1.2由上式可知：(1)增加塔板数可以提高分离度(2)k值的最佳范围是：1＜k＜10(3)相对保留值α增大，能显著地提高分离度两根同种色谱柱的相互关系式：例如:柱长L=30cm分离度R=1.06

柱效n=3490分析时间tR2=17.63min;要使分离度达到R=1.5或以上,就需要改变L,n如果换一根30cm长,但n=7000的柱则tR2=17.63min内可达R=1.5的分离度若采取加长色谱柱的方法,则需要60cm,

分析时间tR2=35min3.分离度R与保留时间tR的关系说明:缩短分析时间的最有效的措施是提高柱效

缩短柱长,增加载气流速也可以提高分析速度但前提是保证足够的R值三、分离条件的优化改变n和Hn=L/HLn但分析时间也增加最好是在不增加柱长的条件下,减少H,以达到增加n根据范氏方程选择操作条件,使H(1).Uopt

选U实稍高于Uopt,一般30ml/min∵右侧平坦U稍变化不会引起H大的变化

U大使tR小,分析速度加快B/UCU(2).固定液及配比降低Cs项(液相阻力),dl(膜厚)要小即配比要低

dl太小有两个缺点:

a.进样量小(肚子小)

b.载体表面被固定液覆盖小,使载体出现极性,因吸附作用会产生拖尾峰(3).载体粒径影响A项Cm项要求惰性,颗粒小而均匀一般80~100目(178-150mm)筛分范围窄好(4).采用小内径的色谱柱柱径4mmHUH柱径2.2mmU40~50目100~150目20~30目2.改变k如图k>5,R变化就很小了GC分析:最好k