《水稻镉稳定低积累品种筛选和鉴定技术规范（征求意见稿）》

DB32DB32/TXXXX-20242024–XX–XX发布2024–XIDB32/TXXXX-2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省农业农业村厅提出、归口并组织实施。本文件起草单位：江苏省耕地质量与农业环境保护站、南京农业大学、中国科学院南京土壤研究所、江苏省生态环境监测监控有限公司、久田环境科技南京有限公司。本文件主要起草人：汪鹏、唐仲、姜海波、骆永明、赵方杰、董歌、郑顺安、杜兆林、李真、邱丹、何振艳、陈彩艳、邱一格、范玉健、张明超、梁晓辉。2DB32/TXXXX-2024水稻镉稳定低积累品种筛选和鉴定技术规范本文件规定了水稻镉稳定低积累品种筛选和鉴定的技术步骤和要求。本文件适用于江苏省主栽水稻品种中镉低积累水稻品种的筛选与鉴定工作，可为其他地区类似工作提供参考。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB2762食品安全国家标准食品中污染物限量GB5084农田灌溉水质标准GB5009.15食品安全国家标准食品中镉的测定GB15618土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化NY/T1300农作物品种区域试验技术规范水稻DB32∕T2853农作物品种试验技术规范水稻HJ1315土壤和沉积物19种金属元素总量的测定电感耦合等离子体质谱法DB32/T1124水稻品种田间试验记载规范DB43/T860杂交水稻种子真实性和纯度鉴定SSR分子标记法HNZ218水稻品种镉积累特性大田验证试验技术规程HNZ219水稻品种镉积累特性多点筛选试验技术规程3术语和定义本标准的试验品种、对照品种、品种试验的相关定义按NY/T1300的规定执行。4试验设置试验组划分、试验点选择及试验点数量的设置按NY/T1300的相关规定执行。5试验品种5.1试验品种申请条件与要求试验品种的申请条件、申请材料、品种数量、种子质量及试验时间按NY/T1300的相关规定执行。试验品种应为适宜当地种植且通过省部级（农作物品种审定委员会）审定的水稻品种。5.2对照品种选择3DB32/TXXXX-2024每组试验需设置3个对照品种：常规对照品种：按NY/T1300的规定选择适合当地种植的主流水稻品种。镉低积累对照品种：选用日本晴或中花11。镉高积累对照品种：选用扬稻6号。6试验田选择6.1试验田基本条件试验田应选择当地代表性的稻田，满足以下条件：•肥力：土壤养分等级为中级及以上，土壤性质和肥力均匀。•排灌：方便可靠，田块形状规正、大小合适。•土壤镉含量：土壤总镉含量应低于GB15618《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》中规定的管制值。6.2试验点选择•试验点选择：参照DB32∕T2853执行，开展多点筛选试验工作，设置7个试验点。•土壤要求：试验田土壤（0-20cm）全镉含量范围为0.10－1.50㎎/㎏，且分布较均匀（三个重复土壤全镉含量变幅≤10%，土壤pH值≤6.0的试验点数不少于50%。•灌溉条件：试验田需具备稳定、清洁的灌溉水源，灌溉水符合GB5084要求。6.3土壤样品采集及制备•采样时间：试验移栽前30天。•采样方法：采用5点取样法，从试验田5个不同位置采集土样，采样深度为0～20cm，每点采样0.3kg，混合后总样品量为1.5kg。•检测项目：土壤全镉含量。•检测时间：在区域试验与生产试验期间。•检测方法与标准：按照HJ1315标准中镉含量测定方法执行。•检测评价：对每块试验田按照GB15618标准定性评价各田块的土壤环境质量等级。6.4灌溉水样品采集及制备•采样时间：在水稻孕穗期，从大田进水口采集2500mL水样。•检测项目：灌溉水中镉含量。•检测时间：在区域试验与生产试验期间检测。•检测方法与标准：按照GB5084标准中推荐的测试方法和标准执行。•检测评价：对每块试验田灌溉水样品根据GB5084标准进行灌溉水质等级评价。7田间设计品种筛选试验采用完全随机区组设计，具体要求如下：7.1区组设置与重复次数•区组设计为完全随机排列，重复3～4次。•每个品种种植5～6行，每行栽植6～8株。4DB32/TXXXX-20247.2区组试验田块要求•区组试验应安排在同一田块内进行，确保试验条件一致性。•区组排列方向需结合试验田实际情况，以利于水流方向和田间操作。7.3保护行设置•试验区域四周须设置保护行，保护行不少于5行，均种植对照品种。7.4操作道设计•区组之间及试验区与保护行之间应设置操作道，宽度不超过40cm。7.5田间布局参考•田间区组及品种排列布局参照附录A，其余设置按NY/T1300的相关规定执行。8栽培管理8.1一般原则播种、移栽及相关操作按NY/T1300的规定执行，确保试验过程的规范性。8.2试验田准备•无论秧田还是本田，翻耕后需要反复耙匀、耙平至少3次，以保证试验田的平整性。•控制小区间土壤镉含量误差最小，前茬稻桩需彻底分解后再翻耕1～2次。•试验田须便于排水，确保管理操作的便捷性。8.3肥水管理•肥水管理参照HNZ219执行，禁止使用钙镁磷肥、过磷酸钙、石灰，以免影响试验结8.4其他要求•其他管理措施：按照当地大田生产的常规习惯进行，以保证试验的实际适应性。•田间记载项目和标准参照HNZ218水稻品种镉积累特性大田验证试验技术规程执行9检验9.1取样水稻进入黄熟期后，各品种种植小区采用5点取样法进行取样。每个品种种植小区取10穴样品、每穴采集2个主分蘖穗，将其混合形成一个籽粒样品。每个品种种植小区采集5株以上水稻的幼嫩叶片，混合形成一个叶片样，低温保存备用。9.2糙米中镉含量测定检测参照GB5009.15执行，分析并依据GB2762评价各品种的镉积累特性，同时整理并列出数据表以供分析和比较。5DB32/TXXXX-20249.3水稻品种的基因型鉴定样品采集与DNA提取：可从不同水稻品种的任何生长期及任何组织中采集样品，提取品种基因组DNA，利用分子标记鉴别基因型。DNA提取及纯化方法参照NY/T674执行。PCR扩增：以不同水稻品种基因组DNA为模板，分别采用qGCd2、LCd-11、LCd-38和LCd-41分子标记引物进行PCR扩增（引物信息见附录）。PCR扩增体系及反应条件按DB43/T860执行。酶切处理：LCd-11、LCd-38和LCd-41分子标记的PCR扩增产物进行相应的限制性内切酶酶切（见附录C酶切体系及反应条件如下：PCR产物10µL，10XCutFastBuffer2µL，内切酶1µL，ddH2O7µL；、37℃反应15分钟。电泳检测：酶切产物及qGCd2PCR扩增产物采用4%琼脂糖凝胶电泳检测，检测方法参照DB43/T860的规定执行。基因型判定：通过电泳条带的大小和位置判定高镉基因型和低镉基因型（见附录B）。qGCd2：高镉基因型PCR产物电泳条带为183bp，低镉基因型条带为149bp；LCd-11：高镉基因型酶切PCR产物电泳条带为100bp，低镉基因型条带为75bp；LCd-38：高镉基因型酶切PCR产物电泳条带为112bp，低镉基因型条带为86bp；LCd-41：高镉基因型酶切PCR产物电泳条带为114bp，低镉基因型条带为86bp。9.4水稻品种主要农艺性状测定水稻品种筛选田间试验的主要农艺性状及综合评价参照DB32/T1124执行。10低镉积累水稻品种判定根据不同水稻品种籽粒镉含量和基因型鉴定结果，结合代表性稳定低镉积累特征的水稻品种（日本晴或中花11）的籽粒镉含量，对低镉积累品种进行评定。低镉积累品种评定标准：•籽粒镉含量：品种籽粒镉含量不高于日本晴或中花11籽粒镉含量值的20%。•水稻品种基因型：4条分子标记（qGCd2、LCd-11、LCd-38、LCd-41）的基因型均为低镉基因型。符合上述条件的水稻品种评定为稳定低镉积累水稻品种。其他性状指标的评价参照NY/T1300的相关要求执行。6DB32/TXXXX-2024（资料性）品种筛选试验田间区组设计及品种排列示意图7DB32/TXXXX-2024（资料性）4种分子标记鉴定高镉和低镉积累水稻品种基因型的差异8DB32/TXXXX-2024（资料性）qGCd2CCCATTGATTAGTTCCCTGATTTTTCACATAAGCAAAATCTTCTTCCCTGACGAAGTTGACAATGTTGCTCATCTCCCTGTTGGGTTTTATTTGCCAGCTCCGAGAGAGGCTGCCTGTCATGGAGGACATATGCGGTTTTGTATAGTATAAGGTAATCAGATAAGGTCATTGCGGTATGLCd-11RCTTCCGCATACCACTGAACTTGTTTGTTTGTGTGGTGCTTTACAATGTAAGTGAAAGTGTTCTTACTGAATCTCATGATTCTAATCTGTTGATTTCCTTCAAAAATAACATTTTTTTCTGTGAATTTTGCAGGTGAATGCATTCCCTATCACTGTCATGTTTGGCATGTGTTCTATCTTCCTCTTCATGGCGGCAATCCTGCAGAGACGGCTAATGGTTGTTTCTGACCTACACAAATCATCGACAAGTATGCATCTTTCTTCATTACTCCACATATAAAAACTAAAATCGCTTTGCCAATCAATTTCTTTGATTCCTAACTGTTGGGGTTAACATTTTCTGCAGAAGCACAAGAGATGGWTGATGAAGATGAGCCACTGAATCCTTAAGGLCd-38GTCACAAAGAAGAAATAATGGCACCATGGTAACTATGCAAGTGGTGAAAGTCTTCAACTGAAAAACCATTTGCTTTTGTTTTCCTTATGGTGCAGTATTCTAACCAAATCAAGAATCATATGTAGAGATTGCAGGGTATTTTATATTTTAATGAAACATTTCACAGGATAAGCATACAGATGCCTTCTCCAATACTGGCTTCAGACAAAAGCAAAGGATATCAGCTAAGACAGAATGATGATGTCATTGGCAGGCAGCAGGGAAGTGGTAAAAGCACCCACAYTGTGTAGGTAAGCATTCCATAAGLCd-41FGGCTCTCAACTCAAGTATTCATCCTTCTGAAATCTGATTTCTCTCTTTCCAATTACCAGTTTTTTTTTTTTTTACTTTCCTCCTGAATAATCTCACTGCTTTAAATTCCTGATATCTTATGATGAAACTGCAAAATGTAAATTCAGA