临床免疫定性实验的质量保证课件

临床免疫定性实验的质量保证一、相关基础知识质量保证(QualityAssurance,QA)

为一产品或服务满足特定质量,要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。也可以说是为了提供信任表明实体能够满足质量要求，而在质量体系中实施并根据需要进行证实的全部有计划和有系统的活动。

室内质量控制（InternalQualityControl,IQC)

由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。室间质量评价（ExternalQualityAssessment,EQA）为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由第三方机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来评价实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力比对检验（Proficiencytesting,PT）。常用临床免疫检验方法三大“标记”免疫检验技术:荧光标记、放射性核素标记和酶标其它标记免疫测定技术：发光物标记、金标、镧系元素标记等免疫沉淀和免疫凝集试验

实验方法的选择公认的参考方法。参照卫生部临床检验中心制定的临床检验操作规范中所推荐的方法。根据权威部门发布的方法学评价结果，选用线性关系好、灵敏度高、特异性强、稳定性好的实验方法。样本的内源性干扰因素：加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀对IQC应定期进行评价在1000个测定结果中超过3SD（99.室内质量控制（IQC）各试剂盒CO值差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，位报告结果的不一致对于临床实验室来说是不可回避，也是目前医疗纠纷主要集中点和“结果互认”的最大障碍，所以必须引入阳性和弱阳性的报告方式。13s:一质控点在±3S之外，为失控。敏感性:患者中阳性百分率洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的关键步骤。加样器及水浴用温度计均应进行计量校准后使用，前者可采用称重法校准，后者可到国家计量单位进行。当底物为OPD(邻苯二胺）时，显色反应应避光进行；05%Tween20的中性PBS。HBeAb、HBcAb溯源性问题酶标仪的校准一定要定时进行（一般使用频繁不超过半年，最多不超过一年）。处于“灰区”的样本，可通过确认试验或重复检测来确定到底是阳性还是阴性。方法的评估

参数设定：真阳性TP，真阴性TN，假阳性FP，假阴性FN敏感性:患者中阳性百分率

公式①：×100％特异性:非患者中阴性百分率公式②：×100％连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测酶标仪的校准一定要定时进行（一般使用频繁不超过半年，最多不超过一年）。公式：×100%l2S：一质控点在±2S之外应警惕。能监测到出现假阳性反应常见的原因。质控小结处于“灰区”的样本，可通过确认试验或重复检测来确定到底是阳性还是阴性。13s:一质控点在±3S之外，为失控。如果重复检测仍然落在“灰区”，则结果可报“阳性”。05%Tween20的中性PBS。参照卫生部临床检验中心制定的临床检验操作规范中所推荐的方法。Westgard多规则质控方法定期对移液器进行维护和校准洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的关键步骤。阴性预测值:在所有阴性结果中非患者百分率7%可信限）的结果不多于3个。R4S：连续2个质控点相差>4S。Westgard多规则质控方法由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，样本的内源性干扰因素：对位于“灰区”和弱阳性结果及少见模式结果进行复查，避免偶然因素及孔间差对结果造成影响根据不同质控工作的具体要求，在Westgard多规则方法中，实际采用的“多规则”本身并非严格的一成不变，而是可多可少，并可以用不同方式进行组合。洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的关键步骤。13s:一质控点在±3S之外，为失控。显色时间：建议在37℃下反应15～30分钟后，终止反应比色测定。如果重复检测仍然落在“灰区”，则结果可报“阳性”。l2S：一质控点在±2S之外应警惕。敏感性:患者中阳性百分率手工洗板要避免气泡残留孔内，洗板机洗板时，将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象。异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体方法的评估

诊断效率:准确区分患者及非患者能力公式：×100%

阳性预测值:在所有阳性结果中真患者百分率公式：×100%方法的评估

阴性预测值:在所有阴性结果中非患者百分率公式：×100%二、影响ELISA测定的因素标本收集实验室测定报告和解释灰区的设置结果报告和解释室内质控

样本的外源性干扰因素：标本溶血标本被细菌污染标本贮存时间过长标本凝固不全冷冻保存标本避免反复冻融样本的内源性干扰因素：类风湿因子补体异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体溶菌酶磷脂药物小分子总蛋白浓度试剂盒的因素

固相材料:聚苯乙烯塑料抗原:纯化、合成和基因工程抗原抗体：多抗、单抗和基因工程抗体酶结合物：酶免疫测定的核心成份色原底物：OPD和TMB运输贮存仪器的校准与标定

酶标仪的校准一定要定时进行（一般使用频繁不超过半年，最多不超过一年）。加样器及水浴用温度计均应进行计量校准后使用，前者可采用称重法校准，后者可到国家计量单位进行。酶免疫测定操作中的注意事项加样温育洗板显色比色结果判断结果报告及解释加样定期对移液器进行维护和校准加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。全自动加样系统的标本“交叉污染”问题。操作时差对结果的影响

温育常采用的温育温度有43℃、37℃、室温等。温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与室温平衡。“边缘效应”的排除:使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度。洗板洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的关键步骤。洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS。手工洗板要避免气泡残留孔内，洗板机洗板时，将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象。机洗的次数要通过多次实验来确定。显色加入底物A和B后，应振荡混匀当底物为OPD(邻苯二胺）时，显色反应应避光进行；底物为TMB（四甲基联苯胺）时，要新鲜配制。显色时间：建议在37℃下反应15～30分钟后，终止反应比色测定。

比色加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适最好选择双波长比色测定，双波长测定能去除背景的干扰，注意避免出现吸光度值为负值的现象。

灰区的概念ELISA“灰区”是把定量分析的正常值范围引入定性分析而建立的概念。即将CO值上下一段区域定为阳性可疑。处于“灰区”的样本，可通过确认试验或重复检测来确定到底是阳性还是阴性。如果重复检测仍然落在“灰区”，则结果可报“阳性”。灰区的设置

灰区”的设置有二种方式：⑴CO（1±CV），CV为该试剂的批内CV(一般在15-20%)；⑵CO±2s，s为实验室做室内质控RCV常规条件下的变异）的标准差。结果判断与报告按照试剂盒确定的Cut-off值判断结果。对于“灰区”的问题，报告方式引入“可疑”较为合理，同时对结果做必要的说明。各试剂盒CO值差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，位报告结果的不一致对于临床实验室来说是不可回避，也是目前医疗纠纷主要集中点和“结果互认”的最大障碍，所以必须引入阳性和弱阳性的报告方式。ELISA检测的原始存根必须完整而全面地保存。室内质量控制（IQC）

IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。

IQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。

对IQC应定期进行评价统计质控方法质控物浓度的选择每次（批）质控物的数量和放置位置质控规则Levey-Jennings质控图方法“即刻法”质控方法质控血清的选择弱阳性质控血清：趋近测定下限的反应物浓度水平；能灵敏的反映试剂盒测定下限的改变，确保弱阳性标本不被漏检。阴性质控血清：避免分析物和微生物之间出现交叉反应；能监测到出现假阳性反应常见的原因。定性免疫测定质控物浓度的选择阳性质控标本选择：可选择S/CO值减去三倍批间CV与该S/CO值的乘积（仍大于1的质控血清作室内质控用，计算公式：

S/CO（1-3CV%）﹥1S/CO比值可在1.5~4之间弱阳性质控标本选择：

选择S/CO处于左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。每块板质控物的数量及位置2～3份弱阳性质控2～3份阴性质控随机放置血液标本中间Levey-Jennings质控图方法

基本的统计学含义：稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以±3s为失控限，假失控的概率为0.3%。Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法

Westgard多规则质控方法

l2S

：一质控点在±2S之外应警惕。

13s:一质控点在±3S之外，为失控。

R4S

：连续2个质控点相差>4S。

41S

：连续4个质控点落同侧±1S之外。７X

：连续7个质控点落均值一侧。室内质控的现状及应对措施

对于抗体检测，尤其是竞争法检测HBeAb、HbcAb，由于不同试剂盒、不同检测方法间CO值存在差异及变异系数大等因素，结果缺乏可比性，在没有统一的判断标准、及明确的临床意义的情况下，引入弱阳性报告方式。由于质控品不稳定，每个月需重新设立靶值对位于“灰区”和弱阳性结果及少见模式结果进行复查，避免偶然因素及孔间差对结果造成影响质控小结

定期召开质控分析会，讨论质量控制情况要在常规条件下建立质控图参数，用S/CO比值绘制质控图采用自制的质控物，是一种经济的方法，关键是要确保质控物的性质稳定使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。变异系数(cv)小于20％

质控小结建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒，更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。

质控小结根据不同质控工作的具体要求，在Westgard多规则方法中，实际采用的“多规则”本身并非严格的一成不变，而是可多可少，并可以用不同方式进行组合。当失控时，能确定产生失控的分析误差的类型，有助确定失控原因以寻找解决问题的办法。乙肝检验存在的问题

HBV基因组变异对病毒HBsAg和HBeAg测定影响问题，以及如何评价试剂盒对这