DB51∕T 3183-2024 医用供体猪 病原微生物监测技术规范

DB51I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定科学院•四川省人民医院、四川泰康医院、南京医科大学附属苏州医院、海南医学院第二附属医院、华爱迪眼科医院、四川省机械研究设计院（集团）有限公司、四王毅、陈刚、杨恒钰、窦科峰、田伟、钟浩、李鑫、姚晓明1医用供体猪病原微生物监测技术规范GB/T36789动物狂犬病病毒核酸NY/T564猪巴氏杆菌病诊断技术NY/T573动物弓形虫病诊断技术2WS/T269布鲁氏菌病诊断通过生物工程技术获得，用于提供医疗用途的活器官或生物材料制备的低免疫原性猪及群体。4代孕母猪病原微生物筛查病，包括猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪细小病毒5.1采样将无菌采样管移入隔离器内，重新罩上传递通道的内侧密封5.1.3.1肛拭子采集5.1.3.2粪便标本采集5.1.3.3鼻拭子采集3样本应尽快进行检测，在24小时内检测的样本可置于2℃~8℃保存；24小时内无法检测的样本则5.2微生物监测4无菌条件下，取饮用水1mL，经0.45μm薄膜过滤法处理，采用R2A琼脂培养基，30℃~35℃培充分混匀，静置10min。取上清液1mL，分别接种到胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、脑心浸液肉汤（BHI）和硫乙醇酸盐培养基（FT），30℃~35℃培养3天～5天。5夜排出残留消毒液。并运行24h以上，利用无菌拭子对隔），豆胨琼脂培养基（TSA）、脑心浸液肉汤（BHI）和硫乙醇酸盐培养基（FT），30℃~35℃培养3天~6根据PHEVS基因序列设计引物和探针，探针在5’端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端标记TAMRA，作为淬灭荧光基团。只要这两种荧光染料彼此靠近，报告荧光基团发出的荧光就会被淬灭荧光基团吸收。在扩增靶序列时，探针被Taq聚合酶降解，导致报告荧光基团和淬灭荧光基团分离。报告荧光基团的荧光信号将变得可检测，并在连续的PCR循环中进一步增A.2样品准备A.2.1样品采集菌塑料袋（自封袋编号，置于冰盒或含有冰袋的保温箱中，密封运送至实验室待检。A.2.2样品保存样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h，若长期保存应置于-70℃超低温冰箱中，避免A.2.3病毒核酸提取A.3cDNA模板制备按表A.1中各组分依次加入PCR反应管，盖紧管盖后，瞬时离心3s，42℃水浴锅中水浴1h；70℃水浴锅中水浴10min；冰浴2min，-20℃冰箱保存备用1×/7上游引物:5'-CCAGGATAAATTT下游引物:5'-AACCAGGACTAACCTTTG5'FAM-ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA-设置空白对照、阳性对照样品和阴性对照样品各1管，每个样品设置3次重复反应。按表A.2中各组分依次加入PCR反应管，盖紧管盖后，500r/mi1×111/2/5注1：实时荧光PCR预混液中包含有PCR扩增酶、扩增注2：反应体系中的各组分可根据不同最终反A.4.3反应参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系A.5质量控制a)空白对照：荧光通道无荧光信号检出，Ct值应大b)阴性对照：荧光通道无荧光信号检出，Cc)阳性对照：荧光通道有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，A.6结果判定被检样品Ct值在35～40之间，应调整模板浓度，重做荧光定量PCR。如再次8Taqman探针法是高度特异的定量PCR技术，是利用Taq酶的5'→3’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，因采样人员应佩戴手套、口罩、等防护装备，保证个人安采样人员用2根棉拭子放入无菌生理盐水中湿润，使用一根拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，擦拭至少3次，然后将拭子头浸入含等渗盐溶液的管中，尾部弃去；另一根拭子轻轻插入鼻道，停留片刻后缓慢转动退出，然后将拭子浸入同一个采样管中，尾部弃去，用含促凝剂或不含添加剂的真空负压采血管采集血液样本5mL，室温静置30min，20rpm离心10min，收集血清于无菌螺口塑料管中。9PCMV-F:5'-TGGCACTGATACTTGACAAGCPCMV-R:5'-CTCCCGTGAAGCCGTAAA5'FAM-CAGCTTGCCCTCAAGGTGAC组分用量(μL）1×