2-3-分子生物学与基因工程

IntroductiontoBiochemicalEngineering

LeiChen,AssociateProfessorDepartmentofPharmaceuticalEngineeringTelmail:lchen@MolecularBiology一、回顾

1、创世说与进化论达尔文、1859年《物种起源》，确立了进化论的概念2、细胞学说（1847）德国Schleiden德国Schwann细胞学说的主要内容有：①细胞是有机体，一切动植物都是由单细胞发育而来，即生物是由细胞和细胞的产物所组成；②所有细胞在结构和组成上基本相似；③新细胞是由已存在的细胞分裂而来；④生物的疾病是因为其细胞机能失常。3、经典的生物化学和遗传学●

19世纪中叶，蛋白质●19世纪中叶到20世纪初，组成蛋白质的20种基本氨基酸被相继发现（1935年，苏氨酸）●著名生物化学家Fisher还论证了连接相邻氨基酸的“肽键”的形成。

孟德尔GregorMendel(1822-1884),奥地利科学家，经典遗传学的奠基人1857-1864的7年中，进行了豌豆的杂交研究，1865年发表了他的划时代的论文《植物杂交试验》在论文中提出了“遗传因子”的概念，并得出了三条规律：●显性规律(TheLawofDominance)●分离规律（TheLawofSegregation）●自由组合规律（TheLawofIndependentAssortment）在孟德尔遗传学的基础上，美国著名的遗传学家Morgan又提出了基因学说。连锁遗传规律二、分子生物学定义

从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学

，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。三、分子生物学发展简史1、孕育阶段（1820~1950年代）●1865年，孟德尔发表了他的《植物杂交实验》一文，首次阐述了生物界有规律的遗传现象。“遗传因子”●

1900年，孟德尔遗传规律被证实，成为近代遗传学基础。●

1910年，Morgan的染色体—基因遗传理论，Gene

存在于染色体上。进一步将“性状”与“基因”相耦联，成为现代遗传学的奠基石。●1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体。1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre

的杂合病毒实验：

烟草花叶病毒的感染和繁殖过程－证实RNA也是重要的遗传物质。2、创立阶段（1950~1970年代）●1953年，美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNADoubleHelixmodel1962年Watson、Crick与Wilkins共享诺贝尔生理医学奖通过对DNA分子的X射线衍射研究证实了前两者提出的DNA的模型●1958年Crick提出中心法则。●1958年，Meselson和Stahl证明DNA半保留复制。半保留复制是遗传消息能准确传代的保证。是物质稳性的分子基础。

StahlMeselson●1959年，美籍西班牙裔科学家Uchoa和美国Kornberg发现了DNA和RNA的生物合成机理而分享了诺贝尔生理医学奖。●1961年，法国科学家Jacob（雅各布）

和Monod（莫诺）提出操纵子学说1965年获得诺贝尔生理医学奖●1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。3、发展阶段（1970年代以后）●

1970年，Temin和Baltimore在RNA肿瘤病毒中发现逆转录酶。1975年，获诺贝尔生理医学奖 ●1977年，Sanger等人发明了一种测定DNA分子内核苷酸序列的方法（双脱氧链终止法）。

桑格(Sanger）吉尔伯特(Gilbert）伯格（Berg）1980年，与Gilbert和Berg共享诺贝尔化学奖Sanger还由于测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。●1983年，美国遗传学家McClintoc因发现可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。1983.BarbaraMcClintock(86y)DNAtransposableelememt

●1989年Altman、Cech发现核酶（Ribozyme,某些RNA具有酶的功能）获Nobel化学奖。

Kohler&Milstein→MonocloningantibodyRoberts&Sharp→SplittinggeneMullis&Smith→PCRtechnique&genemutationinlocusGilman&Rodball→G-proteinasasignalmolecularincellLewis&Nusslein-Volhard&Wieschaus→ControlgeneofbodydevelopinginDrosophila四、分子生物学研究内容●DNA重组技术（基因工程）●基因的表达调控●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学）●基因组、功能基因组与生物信息学研究●DNA重组技术1、可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽

;2、可用于定向改造某些生物的基因组结构;3、可被用来进行基础研究

1972年,Boyer获得第一个重组DNA分子1972-BergEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA五、分子生物学展望

21世纪是生命科学世纪，生物经济时代结构基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学、信号跨膜转导成为新的热门领域。ExamplesofGeneticEngineeringInsulinExamplesofGeneticEngineeringTheCoA-transferaseoftheclassicalclostridialacetonepathwaywasreplacedbyathioesterase.Thenewacetonepathwayisacetateindependent.ExamplesofMetabolicEngineeringDirectphotosyntheticrecyclingofcarbondioxidetoisobutyraldehydeExamplesofMetabolicEngineeringIntroductionofH2pathwaytobalance3HBproductionPolymeraseChainReaction(PCR)聚合酶链式反应-用于DNA的扩增PolymeraseChainReaction(PCR)(I)1993Nobelprizeinchemistry,KaryB.MullisandMichaelSmithPolymeraseChainReaction(PCR)(II)PolymeraseChainReaction(PCR)(III)PolymeraseChainReaction(PCR)PolymeraseChainReaction(PCR)PCRApplicationsPCR的应用AmplificationofageneofinterestforcloningDNAcloning/recombinantDNA技术

重组DNA技术发展史40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

1重组DNA技术诞生的理论基础2.关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基

1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应重组DNA技术发展史重组DNA技术(recombinantDNAtechnique):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)3重组DNA技术的概念重组DNA技术发展史4重组DNA技术的基本步骤1、四大要素

①外源基因②载体③工具酶④受体细胞

重组DNA技术发展史2、重组DNA技术的基本步骤

①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化重组DNA技术发展史重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交重组DNA技术发展史5重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。重组DNA技术发展史酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团6重组DNA实验中常见的主要工具酶重组DNA技术发展史限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）重组DNA技术发展史第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶重组DNA技术发展史Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)即反相重复结构，是

DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG重组DNA技术发展史BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口重组DNA技术发展史DNA连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。T4¯DNA连接酶EcoRI连接酶T7¯DNA连接酶重组DNA技术发展史目的基因的来源原核细胞真核细胞：cDNA或gDNA文库人工合成及PCR扩增目的基因

天然DNA（染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA）重组DNA技术发展史克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。重组DNA技术发展史载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。重组DNA技术发展史个