GB∕ T 40626-2021 杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40626—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。1GB/T40626—2021杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法1范围间调查和病害监测工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T2601植物病原细菌常规检测规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。AplanobacteriumpopuliRidéXanthomonaspopulisubsp.populi分类地位：变形菌门(Proteobacteria),变形菌纲(Gammaproteobacteria),黄单胞菌目(Xan-thomonadaceae),黄单胞菌科(Xanthomonadaceae),黄单胞菌属(Xanthomonas)。杨树细菌性溃疡病菌的相关资料参见附录A。以及致病性测试是本文件检疫鉴定方法的原理。6检测流程检测流程见图1。2GB/T40626—2021待测样品待测样品症状观察分离培养革兰氏染色、鞭毛染色(初筛)烟草过敏性反应、生化特征测定(初筛)按以上实验步骤顺序，若分子特异性检测和致病性测试为阳性则判定为检出分子特异性检测阴性则判7仪器及用具8主要试剂及培养基8.1试剂和材料(MgSO₄·7H₂O)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、溴酚蓝(C₁₉H₁₀Br₄O₅S)、七叶灵(C₁₅H₁₆O₉)、柠檬酸铁3GB/T40626—2021(FeC₆H₅O₇)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、冰醋酸(C₂H₄O₂)、氯化镁(MgCl₂)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶(Taq酶),氧化酶试纸条、细菌微量生化鉴定管、溴化乙锭(C2₁H₂₀N₃Br)、琼脂8.2培养基蔗糖蛋白胨培养基、营养葡萄糖琼脂培养基(NDA)配制按照附录B操作。9检疫鉴定方法9.1症状观察杨树的病害调查或进出境杨树苗木的现场检疫中，若发现枝条皮层产生裂缝，从裂缝中流出灰褐色细菌菌液，或树干出现肿大的、瘤状溃疡斑(见A.2危害情况),取样带回实验室做进一步分离鉴定。9.2寄主组织分离培养按照SN/T2601要求进行操作。取疑似溃疡病症状的树段进行病原菌的分离培养，表面用75%酒精消毒后，去除树皮，把内部变色木材切成长度和厚度3mm～4mm的小块，用无菌水清洗三次。在灭菌离心管中加入少量无菌水，将小块病组织放入无菌水中，并用灭菌研磨棒对小块病组织进行碾压研病组织浸出液，在蔗糖蛋白胨培养基或NDA培养基平板上涂布分离，做不少于5个平板。平板置于25℃下培养4d~5d后观察，若发现可疑菌落(特征为直径3mm~若发现染病苗木皮层裂缝流出菌液，可直接用接种环蘸取并在蔗糖蛋白胨培养基或NDA培养基平板上划线分离，置于25℃恒温培养箱中进行培养，每份样品做不少于5个平板，培养4d～5d后挑取单菌落进行纯化培养。9.3分离菌的鉴定9.3.1革兰氏染色反应进行革兰氏染色试验，要设置阳性菌的对照。若染色结果为革兰氏阴性菌，应进行鞭毛染色试验。革兰氏染色应采用3%氢氧化钾(KOH)溶液进行检测判断。用牙签挑取新鲜待测菌落放在载玻革兰氏阳性菌。9.3.2鞭毛染色反应若分离菌经生物显微镜观察发现有鞭毛并且鞭毛极生，继续进行生化指标的检测。9.3.3烟草过敏性反应取分离的菌株用无菌水配制成约10⁸CFU/mL菌悬液，用灭菌注射器接种烟草叶片背面，置于25℃光照培养，24h～48h观察烟草叶片是否出现过敏性坏死反应。若叶片出现枯斑情况则为阳性反应，若出现黄斑或不明显变化则为阴性反应。同时接种阳性菌株悬液和无菌水分别作为阳性对照和空白对照。采用微量生化鉴定管对可疑菌株和杨树细菌性溃疡病菌标准菌株进行生化指标检测，该步骤也可4GB/T40626—2021使用细菌自动鉴定系统等自动化生化指标检测设备。杨树细菌性溃疡病菌的生化指标测定结果若为七叶灵水解阴性，明胶液化阴性，D-木糖、蜜二糖、棉子糖不产酸，能从甘露糖、半乳糖和果糖产酸，则继续进行分子方法鉴定步骤。生化指标测定方法按照附录B操作。9.3.5分子特异性检测采用试剂盒提取细菌DNA。按照SN/T1193要求进行分子实验的操作。9.3.5.2PCR特异性检测根据杨树细菌性溃疡病菌RNA聚合酶σ-70因子的编码基因(rpoD)设计特异性引物，扩增片段大小为160bp,检测方法及步骤按照附录C操作。采用杨树感病品种的离体枝条，试验在控温的室内或培养箱中进行，温度控制在20℃~25℃。将培养48h的供试菌株用无菌水配制成约10⁸CFU/mL菌悬液，将枝条截成约40cm长的段，在枝条中接种阳性菌株悬浮液和无菌水分别作为阳性对照和空白对照。5d后观察伤口处情况，若发现韧皮部具有软腐症状且有变色情况出现，且在发病组织处分离到供试菌株，则证明供试菌株对杨树有致病性。10结果判定分离得到的细菌菌株经过初筛试验(菌落形态、革兰氏染色、鞭毛染色、烟草过敏性试验、生化特征测定)步骤检测，若PCR特异性检测为阴性，则判定未检出杨树细菌性溃疡病菌。若PCR特异性检测11菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为杨树细菌性溃疡病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于营养葡萄糖琼脂培养基(NDA)斜面上，23℃培养1d后转入4℃低温冰箱中保存，定期(约30d)转接防止病菌死12结果记录与资料保存并要有实验人员和审核人员签字记录。5(资料性)杨树细菌性溃疡病菌相关资料A.1寄主植物A.2危害情况率一般可达12.0%～14.2%,感病树种甚至可达37%。病树主干的溃疡斑使木材的加工利用价值大杨树细菌性溃疡病主要危害10年生大树，幼树少见，1～2年生幼苗不会发生此病，主要危害主干和主枝。在感染初期，使树干形成椭圆形、光滑的小瘤，肿瘤增大成明显后，其韧皮部和木质部出现变色，夏季开裂流出棕褐色黏液，有臭味。病菌进入树体后，在寄主的细胞间隙扩散，溶解细胞壁和中胶株呈秃顶状。病害主要由雨水、昆虫等传播，经皮孔、伤口侵入危害，发病杨树产生的黏液是重要的侵A.3症状杨树细菌性溃疡病菌引起的症状见图A.1。图A.1杨树细菌性溃疡病菌危害症状6A.4形态特征严格好氧，以分子氧为终端电子受体。不能反硝化或硝酸盐还原反应。最适生长温度24℃~26℃。在含有葡萄糖的培养基上产生一种多糖黏液，即荚膜。在多种培养基上可产生黄色色素，色素是极具特征的溴化芳基多烯黄单胞菌素。接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，有机化能营养，不还原硝酸盐。能利用不同的糖和有机酸盐作乳糖发酵产酸，不能液化明胶，可利用乳酸钙而不能利用谷氨酰胺生长，不能利用天门冬酰胺作为唯一的碳源和氮源。0.1%(通常为0.02%)氯化三苯四唑能抑制生长。通常必需的生长因子包括蛋氨酸、谷摩尔分数为62.1%～65.6%。A.6分布情况A.7传播途径传播，远距离传播主要是带菌苗木、接穗等。昆虫能携带病菌，在传病过程中也起了重要作用。人工接种病菌的蚜虫和其他昆虫的传病试验已得到证实。从蛀虫(Cypsonomaaceriana)的虫瘿上和取食幼树昆虫很可能是传病的媒介，而土壤可能是病菌的自然栖息场所。A.8种以下阶元分类目前杨树细菌性溃疡病菌[Xanthomonaspopuli(exRide1958)Ride&.Ridé1992]存在两个亚种，即Xanthomonaspopulisubsp.populi和Xanthomonaspopulisubsp.salicis,其中后者是1977年亚种并入杨树细菌性溃疡病菌(Xanthomonaspopuli),两个亚种可以通过寄主植物、菌落形态、有无运动性、耐盐性高低及生化指标等加以区分。B.1培养基B.1.2营养葡萄糖琼脂培养基(NDA)B.1.3营养琼脂培养基(NA)121℃湿热灭菌15min。蛋白胨2g,氯化钠5g,葡萄糖10g,磷酸氢二钾0.2g,琼脂粉6g,溴酚蓝(先用少量95%乙醇溶B.1.5明胶蛋白胨培养基B.2生化指标测定B.2.1七叶灵水解在营养琼脂培养基中添加0.1%的七叶灵和0.05%的柠檬酸铁。分装试管斜面，121℃湿热灭菌GB/T40626—2021(规范性)分子方法鉴定C.1PCR特异性引