食品生物技术导论第3章

第三章细胞工程与食品产业第一节概述第二节细胞培养技术1第一节概述1.细胞工程也叫细胞技术，是生物技术的主要内容之一。细胞工程植物细胞工程动物细胞工程微生物细胞工程232.基础知识细胞是细胞工程操作的主要对象，细胞是生物体结构和功能的基本单位。生物界有两大类细胞：原核细胞和真核细胞细菌、放线菌等属于原核细胞，细胞小，DNA裸露于细胞质中，不与蛋白质结合，胞内无膜系构造的细胞器，胞外由肽聚糖组成细胞壁。它是细胞融合的主要障碍；不过原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA易于进行遗传操作，因此它们又是细胞改造的良好材料。4酵母、动植物等属于真核细胞，体积较大，内有细胞核和众多膜系构造细胞器。植物细胞外还有数层以纤维素为主要成分的细胞壁。真核细胞一般都有明显细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高度螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也不利于外源基因的插入。因此采取一定的措施诱导真核细胞同步化生长，对于成功的进行细胞融合及细胞代谢产物的生产具有十分重要的作用。5细胞分化和细胞全能性细胞分化：个体细胞发育过程中，后代细胞在形态、结构和生理功能上发生差异的过程。在对多细胞生物中，大多以结合成组织或器官的形式存在，因而细胞的形状一般与其存在的部位和行使的功能有关。在单细胞生物中，虽然没有像多细胞那种典型的细胞分化过程，但是在其生活周期中细胞也表现出有规律的形态结构和生理功能上的阶段变化，这种变化也有细胞分化的性质。6一般来说，体内各种细胞均含有物种的全部基因。但是在细胞中只有一少部分基因在活动。这些表达的基因可分为两类：一是维持细胞生存所必需，称为持家基因；另一类是在各种细胞中专一选择表达的，称为组织专一基因，其表达合成了组织专一的蛋白产物。在具有全能性的胚胎细胞和多功能干细胞水平上，细胞间没有表现出形态上的差异。可是这些细胞经过多次分裂，所产生的子细胞却限定向一定方向发育。7细胞分化能力的强弱称为发育潜能，细胞具有发育成完整个体的潜能称为细胞全能性。但是随着胚胎的发育，有的体细胞虽然具有分化出多种组织的潜能，但是失去了发育成完整个体的潜能，细胞具有的这种发育潜能叫多能性，也就是说，在发育过程中细胞的发育潜能逐渐变窄。8通常情况下，分化细胞的表型要保持稳定，以执行特定的功能。然而在某些条件下，分化细胞也不稳定，其基因活动模式会发生可逆的变化，又回到未分化的状态，这一过程称为去分化。例如如，在培养条件下的植物愈伤组织，它具有全能性，可再生出完整的植株。9在发育潜能上植物细胞不同于动物细胞。高度分化的植物营养组织仍保持着发育成为完整植株的能力，也就是具有全能性。高等动物在发育过程中，产生了体细胞与生殖细胞两个独立的细胞系。动物细胞的分化潜能随分化程度的提高而逐渐变窄。而对于细胞核而言，高度分化的细胞仍保留着物种的全套基因。10动物细胞核移植实验表明，不仅分化的胚胎细胞的核具有指导卵质杂交体发育为成熟个体的全能性，而且高度分化的体细胞的核也具有全能性。也就是说，分化细胞中不表达的基因仍然存在，保持着重新启动表达的潜能，体细胞克隆技术充分证明了这一点。细胞的这种发育的全能性或潜能症是细胞工程中细胞与组织培养、克隆等技术的理论基础。111.2细胞工程的基本操作无菌操作技术细胞工程的所有实验都要求在无菌的条件下进行，稍有疏忽都可能导致试验的失败。实验操作应在无菌室内进行，无菌室应定期用紫外线或化学试剂消毒，实验前后也应消毒。无菌室外应有缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、带帽，做好准备后进入无菌室。12超净工作台是基本实验设备，所有的操作都应在超净工作台上进行。其次对生物材料进行彻底的消毒和除菌是实验成功的前提，实验所用一切器械、器皿和药品都应进行灭菌，实验者双手应戴无菌手套。13细胞培养技术细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要求等方面有很多差异，但它们也有共同之处：首先，要取材和除菌；其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基对培养基进行灭菌或除菌；最后将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供各种细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物量时及时收获或传代。14细胞融合技术两个或多个细胞互相接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合是细胞工程的重要基本技术，其主要过程包括：①制备原生质体，有细胞壁的细胞需用酶或其他方法去壁；②诱导细胞融合；③筛选杂合细胞，一般用选择性培养基筛选。152.细胞培养技术根据所培养的细胞对象不同，细胞培养可以分为微生物细胞、植物细胞、动物细胞的培养。相对于微生物细胞而言，动植物细胞要“娇贵”得多，因此动植物细胞培养要求更高，操作复杂而精细，是细胞培养研究的重点。细胞培养常被泛称为组织培养，它实际上包括了三个不同层次的培养技术：细胞培养、组织培养和器官培养。16细胞培养技术起源于组织培养技术，而组织培养技术是从胚胎学技术开始的。细胞培养的关键首先是解决细胞的营养问题，也就是说要设计和研制出适合细胞生长的营养液，通常称之为培养基。172.1微生物细胞的培养2.1.1培养基的组成一般培养基包括以下组分：碳源。常用的是糖类物质氮源。氮源无机氮源有机氮源氨气铵盐硝酸盐蛋白质氨基酸尿素18无机盐。无机盐是微生物生命活动不可缺少的物质，其主要功能有：构成菌体组成作为酶活性基团的组成调节微生物体内的pH值等维生素。维生素是生物体生长不可缺少的一种或数种极微量的有机物质192.1.2培养基的种类按成分不同分为：天然培养基：有机化学成分不清楚或不恒定的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，如高氏和察氏培养基20根据物理状态划分：固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，使其成为固体状态。常用凝固剂有琼脂、明胶和硅胶该培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、计数、保藏等半固体培养基：在液体培养基中加入比固体培养基中少的凝固剂形成。该培养基常用来观察微生物的运动特性、分类鉴定及噬菌体效价滴定等液体培养基：不加凝固剂。常用于工业生产中和实验室进行微生物的理论研究和应用研究21按用途划分：基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质。加富培养基：也称营养培养基，在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。用来富集和分离微生物鉴别培养基：在培养基中加入特殊化学物质，可与微生物的代谢产物发生特征性变化，根据这些变化鉴别微生物。用于分类鉴定、分离和筛选菌种选择培养基：用来将不同的微生物或某类微生物从群体中分离出来的培养基。22其它培养基：分析培养基：分析某些化学物质的浓度和微生物的营养需求等还原性培养基：专门用来培养厌氧性微生物组织培养物培养基：含有动植物细胞的培养基，用来培养病毒、衣原体、立克次氏体及某些螺旋体等专性活细胞寄生的微生物232.1.3培养方法固体培养在固体培养基表面上培养，多用于菌种分离、纯化、保藏和种子制备。表面培养法操作简便，设备简单，但存在缺点：不适用于大规模生产不便于对体系进行监测控制不宜于保持体系中环境条件的均一单菌落悬浮液琼脂培养基稀释保温培养24在工业生产中，固体培养常用来制曲和进行食用菌菌丝的培养制曲的一般步骤是：将接种的固体基质薄薄的摊铺在容器表面，在一定温度下通风培养。这样就可以使微生物获得充分的氧气，又可以让微生物在生长过程中释放热量。食用菌培养一般用棉籽壳、花生壳等固体基质进行规模生产252.液体培养在液体培养基中，微生物处于悬浮状态，空气通过气液界面传质进入液相，再扩散到细胞内部。采用液体培养可以得到混合均匀的菌体悬浮液，便于检测控制，容易放大到工业生产规模在培养过程中，微生物在生长繁殖过程中有四个阶段：延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期263.连续培养就是将培养基中的营养物质浓度和培养条件维持在对数生长期不变，则可以保证细胞高速增长或产物高速形成。根据控制方式不同，连续培养可以分为恒浊培养和恒化培养。恒浊培养是根据体系内微生物的生长密度，通过自控仪表调节料液的流量，来氏菌体浓度和生长速度恒定的培养方式恒化培养是保持培养液的流速不变，使罐内的营养物质基本恒定，并使微生物在始终低于其最高生长速度的条件下繁殖2728培养方法控制对象生长限制因子培养液流速生长速度产物应用范围恒化培养培养液流速有恒定低于最高生长速度不同生长速度的菌体实验室为主恒浊培养菌液密度无不恒定最高生长速度大量菌体和代谢产物生产为主恒化培养和恒浊培养的比较29连续培养面临的问题单个罐染菌的话，所有的罐都要停止运作，灭菌后再启动连续培养的收率和产物浓度相对于分批培养要低，不利于下游提取连续培养的营养物质利用率低，增加了生产成本连续培养必须与其它工序连贯进行，对设备要求高连续培养更易受菌种退化的影响304.中间补料培养又称为半连续培养、流加培养、补料分批培养等，它是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当添加培养基，使菌体和代谢产物生产时间延长。优点：可以消除底物抑制可以达到高密度培养延长次级代谢产物的生产时间稀释有毒代谢产物降低染菌和避免遗传不稳定性315.同步培养在分批或连续培养中，培养中的细胞并不一定都处于同一生长阶段。，通常微生物的生理生化测定是取群体的平均值，因而并不合理。细胞的同步培养技术，使培养中的细胞同时分裂。同步化方法有两种：选择法：根据处于不同阶段的细胞的性质差异，将其分离出来培养诱导法：控制环境条件，使细胞生长处于相同阶段，从而达到同步培养326.混合培养混合培养互不相干竞争关系互生关系333.2微生物原生质体的制备和融合3.2.1原核细胞的原生质体融合细菌是最典型的原核生物，细菌细胞外有一层成分不同、结构相异的坚韧细胞壁。根据细胞壁的差异一般将细菌分为格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌，前者肽聚糖占细胞壁成分的90％，后者的细胞壁上除了部分肽聚糖外还有大量的脂多糖等有机大分子，由此决定了它们对溶菌酶的敏感性差异很大，去壁方法也不相同。34溶菌酶广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中，它能特异性的切开肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，从而使格兰氏阳性菌的细胞壁溶解。但由于格兰氏阴性菌的细胞壁差异，处理其细胞壁时，除溶菌酶外还要添加少量EDTA（乙二胺四乙酸），才能去除细胞壁，制的原生质体或原生质球。353.2.2原生质体融合和再生融合就是把两亲本的原生质体混合在一起，通常采用PEG融合和电融合。融合过程：原生质体A原生质体B混合离心高渗稳定液40％PEG水浴保温涂布沉渣稀释高渗再生平板细胞分散保温培养检查3637PEG能促进细胞融合的原因是，它是一种具有很强吸水性的大分子物质，能使细胞膜表面的水分和电荷发生变化，从而使细胞发生凝集，细胞膜紧密接触，导致膜分子发生交换、重排，最后细胞膜融合，细胞便合二为一。3839电融合法就是将细胞放在正负电极之间，施加很高的电压，由于细胞表面带有很多电荷，在高压下，细胞靠近正极的一端负电荷聚集，而靠近负极的一端正电荷聚集，这样异性相吸，细胞就会像糖葫芦一样串在一起，相邻的细胞膜紧密接触，这时再施加一个强大的脉冲电流，细胞膜有可能因此受损而产生小孔，由于膜分子的运动，在小孔处的两层细胞就会混合在一起，导致细胞融合。电融合技术的融合效率比PEG法高，而且对细胞毒性小，易于操作。40413.2.3真菌的原生质体融合真菌主要有单细胞的酵母和多细胞菌丝真菌类，同样的降解它们的细胞壁、制备原生质体是细胞融合的关键。真菌的细胞壁成分比较复杂，主要由几丁质及各类葡聚糖构成纤维网状结构，其中杂夹着少量的甘露糖、蛋白质和脂类。因此一般在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入消解酶或蜗牛酶处理。真菌原生质体融合与前述细胞类似。423.4.1微生物融合子的筛选融合重组子（融合子）：原生质体融合后，来自两亲本的遗传物质通过发生交换并发生重组而形成的子代。一般通过两亲本的遗传标记的互补而得以识别，有直接法和间接法。常用直接法：选择标记筛选方法营养互补型高渗再生培养基抗药性含药物的平板培养基形态特征或色素方法色素、形态特征43间接法：把融合液涂布在高渗再生完全培养基上，使亲本细胞和融合子都形成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出融合子。以上获得的仅是融合子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，确定是否为符合育种要求的优良菌种。442.2植物组织与细胞培养2.2.1植物组织培养定义与基本原理：植物组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温度、湿度）条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。45几个重要概念：①愈伤组织：愈伤组织是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。愈伤组织是分化的，但还没有形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。愈伤组织可以用继代培养的方式长期保存，也可以通过悬浮培养而迅速增殖，用作无性系；也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。46②外植体：外植体是指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。③继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物质枯竭，水分散失，并已经积累一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。47植物组织培养的历史20世纪初，德国生物学家Haberlandt曾预言“植物细胞具全能性“。不久，Hanning成功的在他的培养基上培育出能正常发育的萝卜和辣根菜的胚，成为植物组织培养的鼻祖。1943年，美国人White以番茄根为材料，建立了第一个能无限生长的植物组织。481956年，Miller发现了激动素，并指出激动素能强有力地诱导组织培养中的愈伤组织分化出幼芽。1958年，Steward从胡萝卜的细胞培养中分化长出了胚状体乃至整个植株。从此以后，通过组织培养方法培育完整植株的探索便在世界范围内蓬勃开展。49植物组织培养的阶段1.预备阶段：①选择合适的外植体是本阶段的首要问题。选择外植株，要综合考虑以下几个因素：大小要适宜，不宜太小，外植体的组织块要达到2万个细胞以上才容易成活。同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量愈伤组织。50不同物种相同部位的外植体其细胞分化能力可能大不一样。总之外植体的选择，一般以幼嫩的组织或器官为宜。此外，外植体的去分化及再分化的最适条件都需经过摸索。51②除去病原菌及杂菌：选择外观健康的外植体，经可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关，通常幼嫩材料处理时间比成熟材料可短些。对外植体除菌的一般程序如下：外植体→自来水多次漂洗→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干52常用消毒剂除菌效果比较消毒剂使用浓度处理时间（min）除菌效果去除难易氯化汞0.1-1％2-10最好较难次氯酸钠2％5-30很好容易次氯酸钙9-10％5-30很好容易溴水1-252-10很好容易过氧化氢10-12%5-15好最易硝酸银1%5-30好较难抗生素20-50mg/L30-60较好一般53③配制适宜的培养基:由于物种的不同,外植体的差异,组织培养的培养基多种多样,但它们通常都包括以下三大类组份:含量丰富的基本成分,包括蔗糖或葡萄糖、以及氮、磷、钾、镁等；微量无机物，如铁、锰、硼酸等；微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等；各培养基中，激动素和吲哚乙酸的变化幅度很大，主要因培养目的而异。一般较高的生长素（吲哚乙酸）与细胞分裂素（激动素）的比值有利于诱导外植株产生愈伤组织，反之则促进胚芽和胚根的分化542.诱导去分化阶段组织培养的第一步就是让外植体去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，因此培养基中一般应添加较高浓度的生长类激素。可以采用固体培养基（添加琼脂0.6-1.0％），这种方法简便易行，可多层培养，占地面积小。55外植体表面除菌后，切成小片段插入或贴放培养基即可。但外植体的营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅，愈伤组织易出现极化现象是本方法的主要缺点。如把外植体浸没于液体培养基中，营养吸收及物质交换便捷，但须提供振荡器等设备，投资较大，且一旦染菌难以挽回。本阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。563.继代增殖阶段愈伤组织长出后经过4-6周的迅速细胞分裂，原有培养基中的水分及营养成分多已耗尽，细胞的有害代谢产物已在培养基中积累，因此必须进行移植，即继代增殖。同时通过移植，愈伤组织的细胞数能大大扩增，有利于下一阶段收获更多的胚状体或小苗。574.生根成芽阶段愈伤组织只有经过重新分化才能形成胚状体，继而长成小植株。所谓的胚状体是指在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。通常要将愈伤组织移置于合适量细胞分裂素和生长素的分化培养基中，才能诱导胚状体的形成。光照是在本阶段的必备外因。585.移栽成活阶段生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽到室外以利于生长。此时的小苗还十分幼嫩，移植时应在能保证适度的光、温、湿的条件下进行。在人工气候室中锻炼一段时间能大大提高幼苗的成活率。592.2.2植物组织培养的应用1.无性系快速繁殖技术：采用组织培养技术快速繁殖植物是组织培养技术应用于实践生产成效最大的实例。组织培养与传统的无性繁殖相比，不受季节限制，具有用材少、速度快等优点，尤其对一些繁殖系数低、不能利用种子繁殖的名、优、特植物品种的繁殖意义重大。此外虽然一些经济作物可以用种子繁殖，但它们的后代会出现各种变异，不能保持原来品种的特性，因此需要采用组织培养技术进行无性繁殖。602.获得无病毒植株：很多农作物都带有病毒，尤其是无性繁殖植物，如马铃薯、甘草、草莓、大蒜等。一些用无性繁殖方法来繁衍的花卉，如康乃馨、菊花、郁金香、水仙等，不能通过种子途径去除病毒。对于花卉而言会影响其观赏效果，对于经济作物也会影响其产量。如病毒常使马铃薯减产50％左右；苹果被病毒感染后一般要减产14-45％，而且品质恶化、口感变差、不宜储藏。61但是病毒并不是会感染植物的每一个部位，怀特早在1943年就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒，所以茎尖培养成为获得无病毒植株的重要途径。可以取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株可能会不带病毒，从而获得脱病毒植株，再用它进行繁殖，种植的作物就不会或很少发生病毒病害。623.新品种选育：与传统育种相比，利用组织培养技术进行新品种选育具有效率高、周期短、纯度高等优点。采用其他相关的技术，包括诱发突变、远源杂交、单倍体育种，以及细胞融合、基因转移等，特别是通过花药培养进行单倍体育种已成为一种重要的手段，并在生产上获得了巨大的经济效益。634.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用组织培养由于能快速、大量的获得性状一致的实验材料，从而大大推动了植物遗传、生理生化和病理等领域的研究过程。如植物组织培养有助于了解植物营养问题、进行光合作用理论研究、研究植物的抗病性、观察染色体的变异等。通过组织培养，可缩短育种年限和世代，也有利于基因突变中隐性突变的分离。645.种质资源的保存农业是在现有种子资源的基础之上的，由于自然灾害、生物竞争、人类活动等影响，已有相当多的植物物种在自然界消失或正在消失。具有独特遗传性状的生物物种的灭绝是一种不可挽回的损失。目前，很多无性繁殖的植物因没有种子供长期保存，其种质资源传统上只能在田间种植保存，耗费人力物力，且资源易受人为因素和环境的影响而丢失。65利用植物组织培养和细胞低温保存等方法保存种子，可大大节省物力、人力，大大延长保存期。同时也便于种子资源的交换和转移，防止病害。如：胡萝卜和烟草等植物细胞培养悬浮物可在-20℃～-196℃的低温保存数月后恢复生长，再生成为植株。662.2.2植物细胞培养2.2.2.1培养基组成及种类植物细胞培养：在无菌条件下，将立体的单个游离细胞在人工控制的环境里培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。植物细胞体系建立程序：整体植株组织或器官外植体愈伤组织继代培养悬浮培养67植物细胞培养基的组成无机盐类：主要有N、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等。对于不同的培养对象和形式，无机盐的最佳浓度是不同的。碳源：主要是糖类，葡萄糖和蔗糖最为常用。果糖效果比这二者差。通常增加培养基中蔗糖的含量，可以增加培养细胞的次生代谢产物量。68植物生长激素：分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细胞生长，最常用的有吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物，使用最多的是6-苄基嘌呤（BA）、6-糠氨基嘌呤和玉米素。分裂素和生长素通常一起使用，来促使细胞分裂、生长，使用量根据不同细胞株而异。69有机氮源：蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺、氨基酸混合物等。有机氮源对细胞初级培养的早期生长阶段有利，L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。有机酸：加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等，能够保证植物细胞在以铵盐为单一氮源的培养基上生长。加入三羧酸循环中间产物同样能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。70复合物质：复合物质通常作为细胞的生长调节剂，包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等，现在这些制剂通常已被成分已知的营养物质所替代。但许多例子表明，一些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁。712.2.2植物细胞培养方法植物细胞培养有多种方法：有单细胞培养、原生质体培养；有固体培养、液体培养；液体培养又分为摇瓶悬浮培养和大规模悬浮培养等悬浮细胞培养技术是应用最多的一种方法，它是把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。良好的悬浮体系要满足：悬浮培养物分散性好均一性好生长迅速7273建立良好的悬浮体系要注意的事项：选择合适的外植体挑选颗粒细小、疏松易碎、生长快的愈伤组织进行初始培养选择合适的培养基和及时更换新鲜的培养基培养液灭菌时注意选用合适的方法悬浮培养取疏松易碎的愈伤组织在摇瓶中于黑暗或弱光处培养悬浮细胞的继代与选择保留小细胞团，直至得到均一的悬浮系742.2.2.1植物细胞悬浮培养方法分批培养法在新鲜培养基中加入少量的细胞，在培养过程既不从培养系统中放出培养液，也不从外界向培养系统中补加培养基的一种方法特征：培养基基质浓度随培养时间下降，细胞浓度和产物随培养时间增加75半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法反应过程以一定时间间隔进行反复操作，此法可不断补充营养物质，减少接种次数。连续培养法在培养过程中，不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充和保持其恒定体积的培养方法特点：1.能充分供应养分，不会出现悬浮培养物发生营养不良的现象2.可使细胞长久的保持在对数生长期，增殖速率快3.适于大规模工业化生产76连续培养的种类封闭式连续培养：新鲜培养液和老培养液等量进出，并把排出的细胞收集，放入培养系统中继续培养开放式连续培养：新鲜培养液的注入速度等与细胞悬浮液的排出速度，细胞也随悬浮液一起排出。细胞生长稳定时，流出细胞数等于新增细胞数，细胞密度恒定。①浊度恒定法，根据悬浮液浑浊度提高来注入新鲜培养液的开放式连续操作②化学恒定法，通过限制营养物的浓度来控制细胞的增殖速率772.2.2.2植物细胞固定化培养技术固定化细胞培养：即把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维或膜上面或里面，，细胞不能运动，而营养物质可在细胞间流动，供应营养，其特点：可以消除或极大的减弱流质流动引起的切应力固定化细胞生长缓慢导致次生代谢物产量高细胞所处的物理和化学环境与悬浮培养时不同便于操作便于次生代谢物的收集78常见的细胞固定化培养系统平床培养系统本系统由培养床、贮液罐和蠕动泵等组成它能比悬浮培养体系更有效的合成次生物质79立柱培养系统褐藻酸钙固定植物细胞的技术路线为提高次生物质产量，应注意：选用高产细胞株系在营养液中加入目的产物的直接或仅直接前提物理，对增产目的产物有效对各类细胞的培养都应在摸索后找出最佳方案适当光照及通气在多数情况下有利于产物形成802.2.2.3植物细胞原生质体制备与融合81历史上很早就有人提出过，在不同物种间进行杂交，一起获得双方优良性状的杂种生物的美好愿望。然而常规的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰，科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，将目光逐渐转向了细胞融合。1937年，Michel首先实施植物细胞融合试验，如何去除坚韧的细胞壁成了首要的难题。821960年，英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功的制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的原生质体，这使细胞外仅有细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗溶液中才能维持细胞的相对稳定性。此外在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体叫原生质球或球状体。831973年，Keller提出的高钙高pH法为原生质体融合的一个有效方法；1974年加拿大籍华人高国楠首创聚乙二醇（PEG）法诱导原生质体融合；1977年，他又把聚乙二醇法和高钙高pH法结合，1978年，Melchers用此法获得番茄与马铃薯细胞融合的杂种；1979年Senda发明了以电激法提高原生质体融合率的新方法。843.3植物原生质体的制备取材与除菌：一般取生活力较强，再生与分生比例较高的部分，如种子根、子叶、胚细胞、下胚轴、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶等。植株一般先清洗后用酒精消毒，再用3％次氯酸钠处理，最后用无菌水漂洗。85酶解：采用纤维素酶的复合酶或者蜗牛酶，以叶片为例说明制备过程①配制酶解反应液②酶解：除菌后的叶片，撕下表皮，切块，放入反应液中，不时轻摇，反应液转绿③镜检④终止反应86分离：一般选用200-400目的不锈钢网或尼龙布进行过滤除渣，也可用低速离心法或比重漂浮法获取比较纯的原生质体洗涤：用新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2～3次鉴定：在显微镜下可以观察到原生质体的状态，一般细胞呈圆形，放入低渗溶液中易涨破。也可用荧光增白剂染色后在紫外显微镜下观察，如有细胞壁残留会呈现明显荧光。872.2.3.4植物原生质体的融合1.化学法诱导融合化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法，尤其是聚乙二醇结合高钙高pH法已成为化学法诱导细胞融合的主流。88以下简介此方法：按比例混合双亲原生质体→滴加PEG溶液，摇匀，静置→滴加高钙高pH溶液，摇匀，静置→滴加原生质体培养液洗涤数次→离心获得原生质体细胞团→筛选、再生杂合细胞通常，在PEG处理阶段，原生质体间只发生凝集现象。加入高钙高pH溶液后，紧挨着的原生质体间才出现大量的细胞融合，其融合率可达10-50％。这是一种非选择性融合，即可发生在同种细胞之间，也可发生在异种细胞之间。89不过，高浓度的PEG溶液结合高钙高pH溶液对原生质体是有一定的毒性的，因此进行诱导融合的时间要适中。处理时间过短，融合频率较低；处理时间过长，则将因原生质体活力明显下降而导致融合失败。Jelodar近年介绍，以丙酸钙代替氯化钙作为助融合剂，细胞融合频率和植板率都有明显提高，甚至超过了电激融合法。902.物理法诱导融合1979年Senda等发明了微电极法诱导细胞融合。1981年Zimmermann等提出了改进的平行电极法。其基本原理同微生物原生质体融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。91最近，又有人提出以X射线、伽马射线、纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死剂量处理后融合可能造成产生没有供体方染色体的细胞质杂种。利用这种所谓的不对称融合法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。92经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型：①亲本双方的细胞和细胞质能融洽的合为一体，发育成为完全的杂合植株，这种情况不多。②融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象越严重93③融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未完全融合时就过早的被新出现的细胞壁分开，以后它们各自分生长成嵌合植株。942.2.3.5植物细胞杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养，再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否是杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。95杂合细胞的显微镜鉴别：如果双方原生质体在特殊显微镜下或者经不同染料染色后可见不同特征，可作为杂合的标志杂合细胞一方细胞大，一方细胞小一方细胞无色，一方细胞绿色96互补法筛选杂合细胞遗传互补法的前提是获得各种有遗传突变的细胞株系。如不同基因的白化突变株aBXAb，可互补为绿色细胞株AaBb，这叫白化互补。甲菌株缺乏外源激素A不能生长，乙菌株缺乏B不能生长，则甲株和乙株融合，在不含A、B的选择培养基上融合子可能生长，这称为选择互补还有如抗性互补筛选、营养缺陷型互补筛选、代谢互补筛选等。97采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体：把融合后长出的愈伤组织或植株，进行染色体核型分析、染色体谱带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）和随机扩增多态性DNA（RAPD）分析等，来确定是否结合了两亲本的遗传物质。根据融合处理后再生长出来的植株的形态特征进行鉴别982.2.4单倍体植物的诱发与利用单倍体生物是指细胞中仅含一组染色体的个体。单倍体植物比单倍体动物多见。1921年Bergner首次在高等植物曼陀罗中发现了单倍体植物，此类植物与正常二倍体植物相比，叶片小、植株矮小、生活力弱，且高度不育。1924年，Blackeslse等提出了在育种中培植利用单倍体生物，然后加倍获得正常二倍体的设想。991964年，Guha等率先人工诱导毛曼陀罗单倍体植株成功。到80年代末，世界范围的人工诱导单倍体株已达34科88属约250种，其中约1／5是我国科学工作者建立的。在自然界中偶尔也能见到天然诱发的单倍体植株。100天然的单倍体植株通常经以下途径发育而成：孤雌繁殖系统：植物卵细胞不经受精而发育成单倍体孤雄繁殖系统：精子进入囊胚后不与卵细胞受精而独自发育成单倍体胚，再发育成植株，卵细胞退化消失无融合生殖：精卵结合后，不仅受精卵发育，由于某种原因，足细胞或反足细胞与受精卵形成二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子101不过自然界产生单倍体植株的机率很低，小于千分之一。我们可以通过实验室的诱导大量培育出符合需要的单倍体植株。1.花药培养花药由花药壁和花粉囊构成。经过适当的诱导，花粉囊中的花粉（单倍体）可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终形成花粉植株。2.花粉培养由于花药培养时，一些二倍性的花药壁细胞亦能形成愈伤组织，从而增加了培育单倍体植株的难度。1021974年Nitsch等首创用挤压法分离花粉进行培养的方法。1977年Sunderland等提出了自然散开法收集花粉的方法。虽然以花药和花粉培养单倍体植株的研究都已取得长足的进展，但白化苗出现过多仍是有待解决的问题。1033.未授粉子房或胚珠的培养子房、胚珠中的成熟胚囊由6个单倍体细胞（包括一个卵细胞）和1个具2个极核的中央细胞构成。理论上这6个单倍体细胞都可能发育成单倍体植株。1976年SanNoeum首先从大麦的未授粉子房培养获得单倍体植株。虽然该领域的工作目前还开展不多，但由于诱导出的植株大多是单倍体幼苗，因此这可能是一个充满希望的发展方向。1044.杂交法获得单倍体植株杂交，特别是远缘杂交，杂种胚在胚胎发育过程中往往会将一方亲本的染色体逐步排除，最终将得到仅含一方染色体的单倍体植株。1970年，Kasha利用该原理将球茎大麦与普通大麦杂交，培育出了普通大麦的单倍体胚和植株。由本方法得出的单倍体胚长成的植株都是绿苗，这是本方法的突出优点。1055.单倍体培养物的加倍我们之所以要得到单倍体培养物（愈伤组织、幼胚以及植株），其目的是为了对它们进行染色体加倍，从而获得纯合的正常二倍体植物。在诱发单倍体植株的各阶段（形成愈伤组织、幼胚以及小苗），都可用0.2-0.4％的秋水仙素处理24-48小时，然后按常规途径培养，就可能得到染色体加倍的能正常开花、结果的二倍体植株。1062.2.5人工种子的研制人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。1071.人工种子的构成及特点人工种子由以下三部分构成：人工种皮：这是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允许内外气体交换通畅，又能防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏，此外还应具备一定的机械压力。人工胚乳：这是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主要成分。108胚状体：胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根双极性、类似天然种子胚的结构，具有萌发长成植株的能力。人工种子具有以下优点：①可以不受环境因素的制约，一年四季可进行工业化生产；②由于胚状体是经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；③与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田间播种；109④可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利于胚状体的健康生长。虽然人工种子的研制经过十几年取得了长足的发展，但还有一些关键技术仍未攻克，如人工种皮的性能还不尽人意，还未找到符合多数物种需要的人工胚乳，如何让胚状体处于健康的休眠状态，人工种子怎样做到既延长保存时间又不明显降低萌芽等。1102.人工种子的制备①胚状体的制备及其同步生长：由于很多获得的胚状体往往处于胚胎发育的不同时期，不符合制备大量人工种子的需要，因此诱导胚状体的同步化生长成了制备人工种子的核心问题。采取以下措施可促进胚状体的同步生长：低温法：在细胞培养的早期对培养物进行适当低温处理若干小时，由于低温阻碍了微管蛋白的形成，纺锤体形成受阻，滞留于有丝分裂中期的细胞增多，此时再让培养物回复到正常温度，细胞则同步分裂。111抑制剂法：同理，细胞培养初期加入DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶等，是细胞生长基本上都停顿与G1期（细胞分裂间期的第一生长期），除去抑制剂后，细胞进入同步分裂状态。分离法：在细胞悬浮培养的适当时期，用一定孔径的尼龙网或钢丝网或密度梯度离心法，收取处于胚胎发育某个阶段的胚性细胞团，然后转移到无生长素的培养基上，使多数胚状体同步正常发育。112通气法：有人发现，在细胞悬浮培养液中每天通入氮气或乙烯1～2次，每次几秒或更长时间，可显著提高有丝分裂同步率。渗透压法：随着植物胚状体发育从小到大，其渗透压值呈现规律性的从高到低的变化。我们可配制一定渗透压值的培养基而使胚状体的发育停留在指定的阶段，从而达到同步发育的目的。控制细胞及胚状体的同步化生长是一个尚未完全解决的问题，除了上述提出的外因干预以外，物种及不同外植体细胞的敏感性，对实现同步生长也有很大的影响。113②人工胚乳的制备人工胚乳的营养需求因种而异，但与细胞、组织培养的培养基大体相仿，通常还要配加一定量的天然大分子碳水化合物（淀粉、糖类）以减少营养物质泄漏。常用人工胚乳有：MS（或SH、White）培养基＋马铃薯淀粉水解物；0.5×SH培养基＋麦芽糖等。也可根据需要在上述培养基中添加适量激素、抗生素、农药、除草剂等。114③配制包埋剂及包埋褐藻酸钠是目前最好的人工种子的包埋剂，它无毒，使用方便，具有一定的保水、透气性能，价格较低，经氯化钙离子交换后，机械性能较好。其次是琼脂、白明胶等。115通常以人工胚乳溶液调配成4％的褐藻酸钠，再按一定的比例加入胚状体，混匀后，逐滴滴到2.0-2.5％的CaCl2溶液中。经过10-15分钟的离子络合作用，即形成一个个圆形的具有一定刚性的人工种子，而后以无菌水漂洗20分钟，终止反应，捞起晾干。116以上采用滴液法获得的人工种子，其直径随滴管口径的大小而定；每颗种子内含胚状体数目主要取决于包埋剂中胚状体的密度；人工种皮的厚度则随人工种子在CaCl2溶液中离子交换的时间的长短而定，一般掌握在10～15分钟。种皮太厚不利于胚状体萌芽；种皮太薄，则在贮存、运输以及播种过程中都会遇到问题。117④人工种子的贮存与萌芽人工种子的贮存与萌发是至今尚未攻克的难题。一般要将人工种子保存在低温（4-7℃）、干燥（<67％相对湿度）条件下。有人将胡萝卜人工种子保存在上述条件下，两个月后的发芽率仍接近100％，但这种贮存方式的费用是昂贵的，而在自然条件下，人工种子的贮存时间短，萌发率较低。118尽管人工种子的研制尚处于实验室阶段，但它那令人神往的产业化前景正吸引着各国政府和科学家投入巨额资金，付出辛勤的汗水。成功研制人工种子的美好时刻相信不久一定会到来。1195.2植物细胞工程在食品工业中的应用植物中含有大量的次生代谢物，如药用成分、色素、生物碱、酶等。由于植物生长缓慢，满足不了需求，所以工业化培养细胞以提取其产物是一条良好的途径。下面介绍一下各种培养细胞能积累的各种次生代谢产物利用植物细胞工程生产香料：比如甜菊苷（天然甜味剂）、磷酸二酯酶（催化RNA分解为可作调味剂用的核苷酸）、邻苯二酸酐、类萜烯、辣椒素等120利用植物细胞培养技术生产食品添加剂：①色素：甜菜苷②甜味剂：甜菊苷③鲜味剂：5‘核苷酸和有关的酶④防腐剂：没食子酸乙酯⑤增稠剂：琼胶利用植物细胞培养技术生产天然食品：如咖啡碱、可可碱、奶皮蛋白、黄豆甙、琼脂等利用植物细胞培养技术生产植物药材：如人参皂苷、迷迭香酸、醌、小檗碱和治疗心脏病用的辅酶Q－10等1212.3动物细胞培养2.3.1细胞培养基的组成动物细胞培养：离散的动物活细胞在体外人工无菌条件下的生长繁殖，细胞不出现分化，不再形成组织。根据细胞是否贴附于支持物，培养的细胞分为：悬浮型：生长时呈悬浮状态贴附型：贴附于支持物生长122冰冻保存分离培养供体组织细胞原代培养传代细胞系123124培养基的常用成分氨基酸：必需氨基酸，半胱氨酸和酪氨酸等维生素盐：主要是指Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-等金属和酸根离子葡萄糖有机添加剂：包括核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类等激素和生长因素1252.3.2常用培养基天然培养基：取自动物体液或从动物组织分离提取。营养丰富、培养效果好，缺点是成分复杂，来源有限。主要有血清、组织浸液、凝固剂等合成培养基它是对动物体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件下的模拟，给细胞提供了一个近似体内的生存环境，又便于控制和标准化体外生存空间，它是成分已知的培养基，还加入一定比例的天然培养基主要有eagel培养基、DMEM、RPM1640等培养基126无血清培养基无血清培养基就是试图全部采用已知营养成分，包括血清中的细胞生长有效因子，从而代替血清。1272.3.3动物细胞培养方法动物细胞体外培养方法有两种类型：悬浮培养，或者叫非贴壁依赖性细胞培养。贴壁依赖性细胞培养，就是细胞附着在带有适量电荷的固体或半固体表面上进行培养的方法。1281.悬浮培养细胞在培养其中自由悬浮生长的培养方法。动物细胞没有细胞壁保护，所以不能耐受剧烈搅拌和通气，采用滚瓶和转瓶的方法培养，大规模的采用发酵罐培养优点是设备简单、有成熟的理论指导，缺点是细胞密度低易变异，有潜在的致癌危险。1292.贴壁培养将细胞贴附在固体表面介质上进行细胞培养的方法，主要用于非淋巴组织等贴壁依赖性细胞的培养细胞贴壁包括贴壁因子吸附培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面、细胞在培养表面上扩展等几个步骤现在研究人员开发了微载体系统来培养贴壁依赖性细胞，这种方法容易控制和检测细胞生长，培养基利用率高，采用重复性好，收获过程简单，放大容易1303.固定化培养是一种既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式。一般贴壁依赖性细胞采用胶原包埋培养，而对于非贴壁依赖性细胞则通常采用海藻钙包埋。常用的细胞固定化方法有吸附、共价贴附、离子共价交联、包埋和微胶囊化等。1311324.大规模培养法动物细胞大规模培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上，融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。133①中空纤维法：中空纤维是一种由硝酸纤维和醋酸纤维混合物组成的空心纤维，这种纤维具有一定的通透性，它允许小分子营养物自由出入，而大分子物质和细胞则不能随便进出，因此这种纤维结构又叫半透膜管道。用中空纤维培养细胞时，细胞都贴附在纤维外壁生长，而生长所需的营养，则由一台灌流机从内腔不断的灌流供给。这种培养方法在分离和纯化分泌物是很方便，因而在生产激素和单抗体时广泛应用。134②微载体法1967年，VanWezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是由天然葡聚糖聚合物或其它聚合物制成的固体小珠，其直径在几十到数百微米之间。培养动物细胞时，将微载体浸一下血清后和细胞悬浮液混合孵育，等细胞贴附于微载体上后，转至培养液中培养。微载体法能使细胞均匀分布、提高了对培养液和培养空间的利用，适于大规模培养，收获简单，放大生产也容易。135③微胶囊法微胶囊法是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、附酶、离子交换剂、活性炭等大分子物质包裹在其中不能逸出，利用它们催化底物。微胶囊化培养是借鉴此种固定化技术将细胞包埋在微囊中，在培养液中悬浮培养，细胞生长受到一定的保护，细胞密度增加较多，纯度得到了提高。微胶囊化培养对单克隆抗体、干扰素等有用产品的大规模生产提供了一种有效途径。1363.动物细胞融合技术细胞融合是研究细胞间遗传物之间信息转移、基因在染色体上的定位、以及创造新细胞株的有效途径。动物细胞融合的途径有以下三条：1.病毒诱导融合：1958年冈田善雄偶然发现已灭活的仙台病毒（HVJ,副粘液病毒的一种）可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合形成多核体细胞。137科学家已证实，其他的副粘液病毒、天花病毒和疱疹病毒也能诱导细胞融合。仙台病毒诱导细胞融合的方法如下：双亲本细胞细胞悬浮液混和离心细胞沉淀灭活仙台病毒悬浮液混匀细胞凝集细胞融合选择培养基冰浴20分钟间歇摇动水浴37℃，30分钟间歇摇动138如果双亲本细胞都呈单层贴壁生长，则将它们混合培养后直接加入灭活仙台病毒诱导融合即可。本方法虽然建立较早，但由于病毒的致病性及寄生性，制备比较困难；此外本方法诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不够高，所以近年来已不多用。1392.化学诱导融合1975年，Potecorvo用聚乙二醇（PEG）成功诱导动物细胞融合。从此以后，PEG法诱导融合一直成为动植物细胞融合的主要手段，对动物细胞而言，由于它们不具有细胞壁，它们的融合更加简便。关键在于亲本双方要有较明显的可识别的筛选标志（基因和／或性状）。动物细胞的PEG融合方法可参考前述的微生物、植物细胞融合的PEG悬浮混合法进行。1403.电激诱导融合方法参见为微生物和植物原生质体电激融合。与植物杂合细胞筛选的模式类似，动物杂合细胞筛选也可采用抗药性互补性筛选和营养缺陷性筛选方法，此外也有人采用温度敏感突变等特征进行筛选。总之，细胞株具备越多可识别的突变性状，以它为亲本进行细胞融合和筛选就愈容易。1413.4.3动物细胞融合子的鉴定同微生物、植物融合子筛选一样，利用亲本细胞的药物抗性、营养缺陷型和稳定敏感性等遗传标记，进行筛选。另外，在融合前用人工标记亲本细胞，或以致死剂量生化阻抑剂处理亲本细胞，也是一种有效的方法。142目前杂种细胞筛选比较成功的有：由抗性药物组成的杂种的筛选：用各种选择培养基进行筛选有营养缺陷变异型细胞组成的杂种的选择：用适当的培养基进行选择由温度敏感突变型细胞组成的杂种的选择：采用非许可温度进行培养，或根据需要结合适当的选择培养基筛选1433.4.4单克隆抗体技术免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。144（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的后代，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。145（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性