人类白细胞抗原血小板抗原检测技术专家讲座

人类白细胞抗原检测技术，血小板抗原检测技术输血科朱伯平人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第1页人类白细胞抗原HLA(humanleukocyteantigen），(人类白细胞抗原)系统是当前所知人体最复杂多态系统。自1958年发觉(JeanDausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫、遗传学、免疫生物学和生物化学等学科一个主要新兴研究领域。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第2页HLA功效生物学功效：器官和骨髓移植前供、受者组织相容性配型其它方面：亲子判定以及人类遗传学方面人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第3页首个艾滋病治愈病例出现移植骨髓后获抗体

人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第4页年06月03日,对于医生胡特而言，病人蒂莫西·雷·布朗就像漆黑抗艾研究道路上一道亮光。这名被冠以“柏林病人”特殊病患同时兼有白血病和艾滋病。在医学界看来，布朗已经是即将踏入坟墓人，然而在接收骨髓移植后，布朗竟然奇迹般得以重生。这一事件震惊了整个医学界，医生们从他身上看到了医学界奇迹：终止艾滋。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第5页人类白细胞抗原(HLA)HLA抗原分布相当广泛，见于全部有核细胞上，但在淋巴细胞上密度最高血小板上HLA抗原是血小板膜表面固有结组成份，主要是HLA-I类A、B位点抗原HLA-I类抗原是引发血小板同种免疫和血小板输注无效主要抗原，约占80%人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第6页人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第7页HLA抗原检测技术人类白细胞抗原检测技术已广泛应用于器官移植前组织配型检测方法：血清学方法、细胞学方法和基因分型方法与临床输血关系—HLA抗原可引发免疫应答→HLA抗体→发烧性非溶血性输血反应和血小板输注无效人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第8页HLA血清学方法血清学方法：是用一系列已知抗HLA抗原标准血清来检测未知淋巴细胞表面HLA抗原型别。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第9页微量淋巴毒试验原理：淋巴细胞膜表面含有HLA抗原，而分型血清中含有抗特定HLA抗原细胞毒抗体，该抗体与淋巴细胞膜上对应HLA抗原结合后在补体参加下损伤细胞膜，经染料染色后，经过观察细胞是否被染色来判断待测细胞是否损伤或死亡，进而判断抗原、抗体反应强度。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第10页微量淋巴细胞毒试验记分死细胞（%）记分意义0～101阴性11～202可疑阴性反应21～404可疑阳性反应41～806阳性反应0～＞808强阳性反应人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第11页抗血清起源和标准①经过妊娠、输血和同种器官移植等免疫作用产生HLA同种抗体②使用纯化HLA抗原免疫动物，可产生HLA异种抗体③使用杂交瘤技术，可取得单克隆抗体④少数存在天然抗体人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第12页质量标准1.血清特异性程度（FP《3%，FN《14%）2.血清强度，采取强度指数SI表示，SI》70%人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第13页HLA细胞学方法①纯合细胞分型方法②预致敏淋巴细胞试验③混合淋巴细胞培养人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第14页纯合细胞分型方法该方法原理为带有A/A纯合抗原细胞（HTC）作为刺激细胞，带有未知抗原X/X检测细胞作为应答细胞，在两种细胞组成单向混合淋巴细胞培养反应（MLC）中，假如发生刺激反应，表明受检细胞能够识别A抗原当成外来抗原，所以受检细胞不含有A抗原，反之受检细胞可能是A抗原杂合子或纯合子人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第15页预致敏淋巴细胞试验在应答细胞A与刺激细胞B首次混合淋巴细胞培养反应(MLC)中，经过9-12天培养，应答细胞A增生为淋巴细胞后变成小淋巴细胞，即为预致敏淋巴细胞（PL）人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第16页混合淋巴细胞培养两个无关个体淋巴细胞，在体外适当环境下混合培养后能够相互激发，使细胞活化并向母细胞转化，产生分裂增生现象，即为混合淋巴细胞培养方法（MLC）。现MLC主要用于实体器官移植前快速相容性检测。分双向MLC和单向MLC人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第17页HLA基因分型方法PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）序列特异性引物PCR（PCR-SSP）PCR序列特异性寡核苷酸探针分型技术（PCR-SSO）PCR单核苷酸序列分析（PCR-SBT）基因芯片流式细胞术人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第18页粒细胞抗原、抗体检测血清学方法①粒细胞凝集试验（GAT）②粒细胞免疫莹光试验（GIFT）③单克隆抗体特异性粒细胞抗原捕捉试验（MAIGA）④ELISA方法⑤流式细胞术人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第19页基因分型技术主要方法为PCR-RFLP PCR-SSPPCR-SSO等1、PCR序列特异性引物2、PCR限制性片段长度多态性人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第20页血小板血型抗原血小板血型抗原主要有两大类：血小板相关抗原血小板特异性抗原。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第21页血小板相关抗原：血小板表面存在与其它细胞或组织共有抗原血小板特异性抗原（HPA）：通常将血小板表面由血小板特有抗原决定簇组成，表现出血小板特有遗传多态性，而且不存在于其它细胞和组织上抗原。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第22页血小板相关抗原1、红细胞血型抗原：血小板上ABH抗原物质，包含机体所产生以及由血浆中黏附在血小板表面两类抗原组成。2、HLA系统血型抗原：血小板表面主要存在HLA-Ⅰ类抗原，如HLA-A、HLA-B、HLA-C位点等人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第23页血小板特异性抗原血小板特异性抗原(HPA)是由血小板特有抗原决定簇组成，表现出血小板独特遗传多态性，不存在于其它细胞和组织中，当前已发觉血小板特异性抗原已经有8个系统16个抗原国际命名标准是：①在系统前冠以HPA，即人类血小板抗原英文缩写。②各抗原系统以公布日期次序编号。③对偶抗原按人群中频率由高至低用字母命名(比如HPA-1a,HPA-2b)

人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第24页血小板特异性抗原在白种人中HPA-1b表现频率是26.5%，是引发白种人血小板输注无效发生主要血小板特异抗原在亚洲人中HPA－2b抗原频率约为26％，是引发亚洲人血小板输注无效发生主要血小板特异抗原。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第25页血小板血型临床应用一、血小板输注无效定义：血小板输注无效-指患者输注一定量血小板后其增加值显著低于预期值

人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第26页血小板输注无效是因为患者重复输注血小板而产生了血小板同种抗体，造成再次输入血小板时，发生免疫反应。主要是由血小板HLA抗原（HLA-A，-B，-C）以及少数HPA抗原引发，人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第27页HLA抗体在全部病人中到达50%-90%，同时，也有17%-25%HPA抗体出现，缩短输注血小板寿命。在黄种人中，HPA-2b是引发血小板输注无效主要原因之一。治疗方法：输注"配合"浓缩血小板。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第28页观察血小板效果指标校正血小板计数增加值（CorrectedCountIncrement,CCI）人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第29页计算公式CCI=（输注后血小板计数-输注前血小板计数）×体表面积/输注血小板总数×1011人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第30页诊疗标准输注血小板后1小时CCI低于10×109/L或24小时CCI低于7.5×109/L人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第31页引发血小板输注无效原因非免疫学原因免疫学原因人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第32页非免疫学原因脾功效亢进感染发烧药品作用DIC血小板质量问题人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第33页免疫学原因人类白细胞抗原(HLA)血小板特异性抗原(HPA)如检测到患者血清中含有HLA抗体或HPA抗体,即可判断病人无效输注是因为同种免疫引发今后防止输入对应抗原人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第34页其它临床应用二、输血后紫癜多发生在女性，有输血和妊娠史三、新生儿同种免疫性血小板降低性紫癜与新生儿溶血病发病机制相同四、特发性血小板性紫癜人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第35页血小板血型检测技术血小板血型（包含血小板抗原及对应抗体），在临床医学和输血实践中含有主要意义，利用可能方法检测血小板抗体，能够提升血小板输注安全性和有效性。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第36页血清学检测血小板免疫荧光试验（PIFT）：既可用于血小板抗原判定，又能够用于血小板抗体检测和交叉试验1、血小板抗原判定：待测血小板用于聚甲醛（PFA）或氯喹预处理，处理过血小板与已知特异性抗血清孵育，洗涤，再与标识了异硫氰酸荧光素抗人球蛋白孵育，再次洗涤并在荧光显微镜下进行观察。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第37页血小板抗体检测和交叉试验利用已知抗原特异性血小板细胞谱与待检血清混合反应，其余步骤与血小板抗原判定类似，最终依据血清血小板细胞谱反应情况，来判定血清中抗体特异性。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第38页PIFT优点①因为在显微镜下只观察荧光标识血小板，所以能够防止因为细胞碎片等引发非特异性反应。②多特异性抗球蛋白能够识别人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第39页流式细胞术流式细胞术(FCM)1986年,Rosenfeld等创造了此技术。该法将待测血清和荧光标识已知型别血小板抗体孵育后，用流式细胞仪检测。FCM用于免疫性血小板降低症患者血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白检测,含有灵敏、快速、简便特点,是适合用于临床诊疗新方法。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第40页单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：该法先制备羊抗鼠IgG包被多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体血小板共同孵育，再将孵育后复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最终加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第41页特点此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量极少HPA-5抗原，也能检测出。MAIPA方法可灵敏地检测血小板特异性抗体。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第42页简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）：该法以抗人IgG抗体致敏红细胞为指示细胞，直接指示固相血小板抗原抗体免疫反应，检测血小板抗体。若血小板上存在抗体，则指示细胞呈扩散分布，为阳性；若无抗体，则指示细胞聚集在底部，呈扣状，为阴性。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第43页特点该方法操作简单，微量，重复性、特异性和敏感性均较理想，固相化血小板及抗IgG指示细胞能长久保留备用，可开展大量样本检测工作。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第44页基因分型方法1.聚合酶链式反应序列特异引物分型技术（PCR-SSP）原理：设计特异性引物，利用引物3'端特异性，直接扩增对应HPA片段，PCR产物凝胶电泳以后，以紫外线透射来检测，DNA条带存在或缺失即可确定基因型。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第45页特点SSP-PCR操作比较简单，耗时较少，适合小批量标本，是当前HPA基因定型中最惯用一个技术。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第46页2.实时定量PCR实时定量PCR原理：在PCR指数扩增期间，利用连续监测荧光信号强弱来即时测定特异性产物量，并据此推断目标基因初始量。这一方法成功利用于HPA-1、-2和-3基因定型。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第47页特点它广泛应用于定量检测mRAN表示水平，其特点是易操作、高通量、敏感性高和特异性强。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第48页基因芯片技术（DNAmicroarray）基因芯片技术利用正向杂交方法，制成针对HPA基因SNP位点DNA芯片；用荧光标识HPA型特异性探针分别与芯片进行杂交，用软件分析样品杂交结果，从而确定样品HPA基因型。此技术特点是一次性可同时检测大量样品，快速，准确。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第49页限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）原理是：限制性内切酶能够识别DNA序列上特异性位点，并切割产生一定长度DNA片段。相关基因片断用含SNP区域引物进行扩增，扩增产物用一个限制性酶进行降解，酶解PCR产物进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，最终在紫外线下进行DNA片断带型分析。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第50页该法特点是RFLP是利用限制性内切酶酶解对应位点扩增产物，不需探针杂交，但被测HPA基因需有适当限制性酶切位点。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第51页聚合酶链式反应－等位基因（序列）特异性寡核苷酸杂交（PCR-ASO）：用PCR扩增SNP基因序列，扩增产物连接到尼龙膜支持物上，再与标识等位基因特异性指示物-寡核苷酸探针杂交。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第52页该方法特点是以杂交为基础检测技术，但需严格控制杂交条件和设置标准对照防止假阳性和假阴性。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第53页同源双链优先形成试验（PCR-PHFA原理：双标识扩增产物（标准双链DNA，它两条链分别被生物素和邻苯二甲酸二壬酯(dinonylphthalate,DNP)标识与未标识待测DNA双链之间杂交时竞争该人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第54页方法特点：不需要电泳，可用软件进行结果判读。人类白细胞抗原血小板抗原检测技术第55页血小板抗原同种免疫反应机制HPA可诱导受血者体内产生一系列同种免疫反应。通常有两种反应路径：直接路径和间接路径。