纳米技术 利用紫外圆二色性评估纳米材料引起的蛋白质二级结构变化 征求意见稿

1GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021纳米技术利用紫外圆二色性评估与纳米材料作用的蛋白质的二级结构本文件规定了利用紫外圆二色（UV-CD）光谱法测定蛋白质与纳米材料相互作用引起的二级结构变化的测量方案和测试条件。本文件不适用于表征无序蛋白质的构象变化。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO/TS80004-1纳米科技术语第1部分：核心术语（Nanotechnologies—Vocabulary—Part1:Coreterms）注：GB/T30544.1—2014纳米科技术语第1部分：核心ISO/TS80004-2纳米科技术语第2部分：纳米物体（Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:Nano-objects）ISO/TS80004-4纳米科技术语第4部分：纳米结构材料（Nanotechnologies—Vocabulary—Part4:Nanostructuredmaterials）注：GB/T30544.4—2019纳米科技术语第4部分：纳米结构ISO/TS80004-6纳米科技术语第6部分：纳米物体表征（Nanotechnologies—Vocabulary—Part6:Nano-objectcharacterization）注：GB/T30544.6—2016纳米科技术语第6部分：纳米物体表3术语和定义ISO/TS80004-1、ISO/TS80004-2、ISO/TS80004-4和ISO/TS80004-6界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1纳米颗粒nanoparticle；NP三个维度的外部尺寸都在纳米尺度的纳米物体，纳米物体的最长和最短轴的长度没有明显差距。注：如果纳米物体最长轴和最短轴的长度差别显著（大于3）时，应当用纳米纤维和纳米片来表示纳米颗粒。[来源：ISO/TS80004-2：2015，4.4]3.2纳米材料nanomaterial任一外部维度、内部或表面结构处于纳米尺度的材料。2GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021[来源：ISO/TS80004-1：2015，2.4]3.3圆二色性circulardichroism对左旋和右旋圆偏振光吸收差异的光学效应。4缩略语以下缩略语适用于本文件。AgNP：银纳米颗粒（silvernanoparticle）AuNP：金纳米颗粒（goldnanoparticle）AU：吸光度单位（absorbanceunit）BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）CD：圆二色性（circulardichroism）DLS：动态光散射（dynamiclightscattering）HSA：人血清白蛋白（humanserumalbumin）MRE：平均残基椭圆率（meanresidueellipticity）MWCNT：多壁碳纳米管（multiwallcarbonnanotubes）NOAA：纳米物体及其聚集体和团聚体（nano-objectsandtheiraggregatesandagglomerates）PAA-AuNP：聚丙烯酸包覆的金纳米颗粒（poly(acrylicacid)-coatedgoldnanoparticles）SRCD：同步辐射圆二色性（synchrotronradiationcirculardichroism）SWCNT：单壁碳纳米管（single-wallcarbonnanotubes）UV-CD：紫外圆二色性（ultravioletcirculardichroism）UV-Vis：紫外/可见（ultraviolet-visible）5纳米材料与蛋白质的相互作用在生物环境中，NOAA容易与载脂蛋白、纤连蛋白、HSA、玻连蛋白等蛋白质发生相互作用[5]。NOAA周围结合或吸附的蛋白质层被称为蛋白质冠。纳米材料的物理化学性质（如尺寸、表面积、疏水性、电荷密度、表面化学、形貌）可能会影响其与周围生物分子的相互作用。这种相互作用依赖于蛋白质的结合和解离动力学。纳米材料-配体复合物的寿命从微秒到数天不等[3-9]。蛋白质与纳米材料相互作用后，其二级结构可能发生可逆或不可逆的构象变化。蛋白质与纳米材料相互作用引起的二级结构微小变化多数是可逆的，但显著的蛋白质二级结构改变则极可能是不可逆的。这些变化可以通过监测UV-CD光谱获得[9]。UV-CD光谱测量的是手性物质的电子从基态跃迁到激发态的光物理过程。UV-CD光谱法广泛用于蛋白质的二级结构、蛋白质折叠及其结合特性的表征[4-6]。该技术使用偏振光测量物质对左旋和右旋圆偏振光吸收差异产生的UV-CD信号。波长小于240nm的吸收来自肽键，而在260nm~320nm的吸收来自芳香氨基酸的侧链。α-螺旋、β-折叠和β-转角都是最常见的二级结构单元（参见附录A和图C.1）。需注意的是，芳香氨基酸的侧链也可能对小于240nm的CD光谱有贡献。此外，二硫键可能对这两个波长区间的CD光谱也有贡献。蛋白质三级结构表征则超出了本文件的范围。采用UV-CD测定与纳米颗粒作用的关键人源蛋白的结构变化已有报道（参见表B.1）。例如，人转铁蛋白与超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPION）、纤维蛋白原与AuNP相互作用引起的不可逆结构改变导致相应蛋白质主要生物功能的丧失[10]。通过使用UV-Vis、透射电子显微镜（TEM）和UV-CD的测量方法研究AgNP和HSA之间的相互作用，探索纳米颗粒与细胞相互作用中物理力的角色。研究表明，氢键、3GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021静电和疏水相互作用介导了二者的结合，导致α-螺旋减少，β-折叠增加，进而改变蛋白质的生物功能[11]。利用SRCD光谱法研究了HSA-AgNP的相互作用和稳定性，结果表明蛋白质结构中的α-螺旋含量减少。Mac-1蛋白与PAA-AuNP结合产生错误折叠，促使其与整联蛋白受体发生相互作用。该受体的激活增强了NF-kB信号通路，导致炎症细胞因子的释放[14]。6样品制备6.1概述UV-CD光谱仪需带有温度控制元件，其波长范围175nm～700nm。需配备光程从0.5mm～10mm的石英玻璃比色皿（矩形或圆柱形）。便于UV-CD光谱获取，所用材料、溶剂和缓冲溶液应在紫外区吸收低，并尽可能透明。使用具有光学活性的缓冲溶液会带来很多问题，因此不建议使用（见表C.1、C.2和C.3）。处理蛋白质溶液时，应使用经特殊处理的与蛋白质亲和力弱的玻璃器皿。所有溶液均应使用去离子水配制。6.2UV-CD石英比色皿的性能要求宜使用透明度高的石英比色皿采集UV-CD光谱。石英比色皿应无光学活性，所需光程范围为0.5mm～10mm（矩形或圆柱形）。每次测量前应彻底清洗比色皿（参见附录C）。6.3蛋白质溶液制备在与蛋白质亲和力弱的的试管中称取蛋白质，并加入缓冲液制成浓度合适的储备溶液。所需的浓度可使用分光光度法通过摩尔消光系数来确定[11]。缓冲溶液应根据研究中使用的蛋白质和纳米颗粒的类型进行选择。制备浓度范围为1mg/mL～5mg/mL的蛋白质储备溶液。然后，对储备溶液进行适当的稀释进行UV-CD测量。蛋白质的UV-CD光谱使用0.5mm～10mm比色皿采集。根据光程和缓冲溶液类型，可测定蛋白质的浓度范围为0.005mg/mL～5mg/mL。但蛋白质含量在0.005mg/mL～0.3mg/mL之间时，可获得理想的UV-CD光谱。典型的UV-CD测量如下：—0.5mm比色皿：蛋白质浓度0.2mg/mL～1mg/mL时，所需体积为0.025mL～0.05mL；—1mm比色皿：蛋白质浓度0.05mg/mL～0.2mg/mL时，所需体积为0.3mL～0.4mL；—2mm比色皿：蛋白质浓度0.1mg/mL～0.3mg/mL时，所需体积为0.9mL～1mL；—10mm比色皿：蛋白质浓度0.005mg/mL～0.01mg/mL时，所需体积为3mL至4mL。蛋白质宜产生足够强的UV和UV-CD信号。蛋白质溶液在UV波长处的吸光度宜在0.5AU～1AU之间，最佳吸光度为0.89AU（参见图C.2）。6.4仪器条件设置在仪器开机前，需要用氮气对其吹扫30min～60min（制造商建议的时间）。使用水套式恒温比色皿支架/软件控制的珀耳帖效应调控循环水浴的实验温度。根据实验需要设定水浴温度，并在整个实验过程中保持温度恒定。实验前宜打开光源，确保光信号输出稳定（30min～40min）。6.5UV-CD光谱的采集步骤6.5.1概述在UV-CD开始测量前，将温度设置为所需温度（25℃)[3-4]。为了获得合适信噪比下足够的光谱分辨率，将光谱带宽设置在1nm～1.5nm之间。根据所使用的样品和比色皿调整波长范围：—0.1mm比色皿中0.2mg/mL～0.8mg/mL的蛋白质样品，190nm～260nm；4GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021—1mm和2mm比色皿中0.1mg/mL～0.2mg/mL的蛋白质样品，190nm～260nm；—10mm比色皿中0.01mg/mL～0.02mg/mL的蛋白质样品，190nm～260nm。对于低椭圆度、信噪比在0.1nm～0.25nm之间的样品，数据采集间隔宜为1nm。UV-CD光谱推荐的测量范围为190nm～260nm。数据宜按1nm/s的速率进行采集。6.5.2缓冲溶液采集缓冲溶液的光谱确保其没有任何椭圆度。确保狭缝宽度、扫描步长、积分时间和扫描速率/积分时间等测量参数与样品测量时的参数一致。当缓冲溶液与蛋白质的UV-CD引起任何重叠的响应时，都可能产生误导性的结果。缓冲溶液与去离子水吸收比的增加会降低信噪比。缓冲溶液和去离子水的光谱在实验误差内宜尽量重叠，但通常在短波长区域，缓冲溶液比去离子水的光谱具有更低信噪比[4]。—推荐使用磷酸钠或磷酸钾缓冲溶液溶解蛋白质，最佳浓度为10mmol/L，也可作为空白样品。—避免使用干扰UV-CD光谱的缓冲溶液，如柠檬酸盐、3-(N-吗啉)丙磺酸（MOPS）、咪唑和二硫苏糖醇（DTT）。缓冲溶液及其UV截止波长如表C.3所示。—在样品CD光谱测量前，先采集缓冲溶液的CD谱。得到的空白CD光谱宜相对平坦，以确保缓冲溶液对吸光度产生影响。6.5.3蛋白质样品在干净的比色皿中加入蛋白质溶液，采集UV-CD光谱。重复测量5次～6次。将所有光谱叠加并对数据加取平均。对样品和空白光谱进行平滑处理[4]。多种方法可用于光谱平滑。一般采用基于3阶多项式和20点平滑窗口的萨维茨基-戈莱平滑算法。从样品的平滑光谱中减去平滑基线[4-15]。大多数蛋白质在250nm～260nm之间的椭圆度宜接近于零。6.5.4纳米颗粒悬浮液在蛋白质溶液中的稳定性需对纳米颗粒在的缓冲溶液中的稳定性进行测试，避免纳米颗粒发生任何团聚。理想情况下，纳米颗粒在样品和对照中的团聚状态宜相同。然而，许多研究表明蛋白质可以增强颗粒团聚。所以这个设想多半是不可行的。因为对纳米颗粒的团聚进行初步研究，能够为缓冲液和颗粒浓度的选择提供关键信息。所以在进行UV-CD分析之前，宜先进行初步研究，并作为实验设计的一部分。团聚测量可通过DLS技术实现（参见参考文献[15]和ISO22412[16]）。6.6蛋白质-纳米颗粒结合物悬浮液的制备蛋白质-纳米颗粒结合物悬浮液的制备如下：a)使用与蛋白质亲和力弱的玻璃小瓶。b)根据计算的所需蛋白质储备溶液的体积，用移液器在每个小瓶中加入相同的体积。c)在玻璃小瓶中加入足量的去离子水，得到一定浓度的蛋白质溶液。d)轻摇小瓶，并在在室温（25℃)下孵化5min。e)在蛋白质溶液中加入一定体积的纳米材料悬浮液（10μg/mL～100μg/mL轻轻混合（蛋白质和纳米颗粒的合适比例参见附录E）。f)将制备好的样品在室温下（25℃)下孵化4h。g)将溶液转移到UV-CD比色皿中。h)在室温（25℃)下，采集190nm～260nm区间的UV-CD光谱。在光谱带宽1nm、扫描速率50nm/min下采集数据，重复测量5次～6次并进行平均。最终的光谱宜进行基线校正，数据用平均残基椭圆率（MRE）表示，如6.8所述。6.7UV-CD光谱测量5GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021按如下步骤测量UV-CD光谱：a)采集所用缓冲溶液的UV-CD光谱（参见表C.1和表C.2）。b)纳米颗粒分散液中可能有试剂残留。采集相应溶液的UV-CD光谱。c)测试所用纳米颗粒在190nm～260nm区间的紫外吸收。如果纳米颗粒在该区间的吸光度大于1.0AU，则该颗粒不适合UV-CD实验（参见图C.1和图C.2）。d)重复测量蛋白质-纳米颗粒分散体系的UV-CD至少5次～6次，验证测试重复性。如果重复性不能接受，则可能平衡时间不足或悬浮液不稳定。e)从样品数据中减去背景/空白光谱。应采集NOAA在190nm～260nm区间的CD光谱。非手性NOAA在具有强CD信号的NOAA不适合做这个测试。NOAA、空白样品和蛋白质样品的CD采集步骤应完全相同。6.8摩尔椭圆率计算蛋白质中的α-螺旋含量可以通过公式（1）将UV-CD信号（参见图C.2和表D.1）转换为MRE进行定量分析：…………式中：[θ]——222nm处的MRE，单位为deg.cm2.dmol-1；θ——测量得到的椭圆率，单位为deg；C——蛋白质的摩尔浓度，单位为mol/L；n——氨基酸残基的数量；l——光程，单位为cm。螺旋含量利用公式（2）计算：…………………式中：H——α-螺旋含量（%[θ]——222nm处的MRE；3000——222nm处无规卷曲和β型构象混合的MRE[θ]；36000——纯α-螺旋在222nm处的MRE[θ]。6.9数据分析通过UV-CD光谱的定量分析可对蛋白质二级结构的变化进行评估。蛋白质圆二色数据库（PCDDB）公开提供了许多有效的参考光谱[17]。可以采用不同的方法对UV-CD光谱进行去卷积（参见表F.1）。有许多平台可用于评估蛋白质的结构含量，如CDPro[18]，ValiDichro[19]，PDB2CD，K2D3，DichroCalc，DICHROWEB，CCA+[20]和Beta结构选择（BeStSel）[21-22]。其他一些简化的程序也可用于蛋白质结构含量的定量[4,21,23-24]。应用这些方法可以评估蛋白质的二级结构，并测量蛋白质-纳米颗粒相互作用引起的蛋白质三维结构的变化。蛋白质二级结构的变化在5%以上可以认为是显著的，≥90%则认为其已变性[56]。测量的UV-CD光谱可以以文本文件上传到网络服务器（参见附件G也可以以两列数据的形式复制到给定的窗口；数据的单位为deltaepsilon、MRE或mdeg。建议输入数据的波长间隔为1nm。结构含量评估的输出结果包括实验和估算光谱图、二级结构组成列表、总量、均方根偏差（RMSD）和归6GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021一化RMSD（NRMSD）数据的拟合光谱。文件可以以图形格式或文本格式保存，方便进一步的数据或图形处理。用户可以调整波长范围和使用比例因子重新计算结果。输出的数据格式可由用户进行修改。7测试报告测试报告应包括表1中的信息。表1测试报告基本信息产品名称：产品用途：批号：批量编号：制造方法：实验室名称：实验室地址：NOAA表征尺寸化学组成形状表面化学NOAA浓度a蛋白质表征蛋白质浓度（mg/mL）pH二级结构含量的评估结构含量蛋白与NOAA作用前（%）蛋白质与NOAA作用后（%）螺旋反平行式平行式其他RMSDNRMSD用于蛋白质结构含量分析的数据库类型：a浓度以μg/mL表示。7GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021蛋白质典型UV-CD光谱图a）在远紫外区的各种蛋白质二级结构b)具有不同构象的典型蛋白质说明：2β反平行式3延展结构4胶原蛋白（三螺旋）5胶原蛋白（已变性）6肌红蛋白7LDH8胰凝乳蛋白酶9本周氏蛋白图A.1UV-CD光谱图8GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021关于NOAA和蛋白质结构变化的文献检索表B.1NOAA引起的蛋白质构象变化纳米颗粒类蛋白质类形状尺寸表面性质纳米颗粒浓度蛋白质浓度pH结论参考文献AgNP溶菌酶球形4nm20nm100nm带负电1:1000（100nm为1:250）2.3×10184nm5.9×101620nm6.4×1014100nm50µg/mL9.26.95.0不可逆。对于所有颗粒尺寸，溶菌酶吸附随pH减小而减小。对于100nm颗粒，大部分蛋白质去折叠。[25]AgNP细胞色素C—4nm35nm带负电20.0µg/mL200µg/mL7.0可逆。较大尺寸的AgNP，二级结构损失很少。[26]AuNP细胞色素固体表面2nm~4nm—0nmol/L～18nmol/L3.5µmol/L7.2细胞色素C可通过疏水相互作用吸附在2nm～4nm的AuNP上。每个2nm～4nm的AuNP上吸附的细胞色素C不低于20个。细胞色素C可通过静电相互吸附上吸附的细胞色素C为200个。[27]SiO2核糖核酸酶A球形4nm带负电10mg/mL7.4可逆去折叠。在具有较小表面曲率的较大NP上，酶的稳定性进一步降低。[28]AgNP人碳酸酐固体表面6nm9nm带负电5.09×10179nm50µmol/L8.4采用超离心法和凝胶渗透色谱法进行脱附。直径为15nm的颗[29]9GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021（HCAI）7.30×10176nm（颗粒数/mL）HCAI：AgNP（所有颗粒尺寸）粒引起的二级结构变化比直径为6nm的颗粒约6倍。PAA-AuNP纤维蛋白原球形5nm20nm带负电20µg/mL30µg/mL40µg/mL7.4带负电荷的NP可能使纤维蛋白原去折叠，所以PAA-AuNP引起蛋白质二级结构的损失。[30]AgNP矮刀豆尿酶（JBU）球形带正电1000µmol/LJBU:AgNP[1:1,1:2,1:3,1:4,1:5(v/v)]40µmol/L8不可逆变化。在较高颗粒浓度形成蛋白质-纳米生物偶联物。在较高AgNP浓度形成的蛋白冠完全抑制了脲酶的酶活性。[31]CuNPBSA（牛血清白蛋白）球形7.5nm立方体结构1.58×10-4µmol/L3.53×10-4µmol/L7.34×10-4µmol/L11.66×10-4µmol/L5µmol/L因与CuNP的发生相互作用，BSA的α-螺旋度降低。[32]AgNP真菌蛋白（臭曲霉）—5nm—1:0µmol/L2:12.5µmol/L3:25µmol/L（蛋白质:AgNP）1mg/mL7.4AgNP与真菌细外蛋白结合可引起蛋白质的不可逆改变。[33]Ag-PVTNP人血清白蛋白（HSA）———2.4×10-5mol/L4×10-5mol/L8×10-5mol/L16×10-5mol/L24×10-5mol/L32×10-5mol/L1.5µmol/L7.4Ag-PVPNPs轻微改变了蛋白质的285-二级结构。[34]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:202140×10-5mol/L60×10-5mol/L80×10-5mol/LZnONPα-乳白蛋白球形4nm~7nm带正电1:1～1:10（蛋白质:NP）7.4ZnO和蛋白质可通过静电、疏水或二者兼有的作用相结合。疏水相互作用可破坏蛋白质结构，而静电相互作用可稳定蛋白质。[35]C60NP人血清清蛋白（HAS）球形50nm~—3.38µmol/L5.63µmol/L11.8µmol/L7.3µmol/L7.4与nC60结合后，HSA的α-螺旋度百分比增加，蛋白变得更紧密。[36]CdS-QDNP溶菌酶球形2nm~3nm巯基丙酸、谷胱甘肽、L-半胱氨酸包覆的，带负电0.4µmol/L 8µmol/L1.2µmol/L1.6µmol/L24.0µmol/L7.4当3种CdS-QD的浓度达到2.4×10-5mol/L时，Lyz螺旋度含量突然下降，Lyz开始变性。[37]CdS-QDNPBSA球形2nm~3nm0.4µmol/L 8µmol/L1.2µmol/L1.6µmol/L24.0µmol/L3µmol/L7.4MPA-CdS量子点的浓度增加到2.4×10-5mol/L，BSA的α-螺旋含量没有恢复到其在MPA-CdS量子点中的初始值。随GSH-CdS量子点浓度增加，BSA中α-螺旋含量降低。[37]HO-SWCNTNP血红蛋白肌红蛋白实心圆柱形外径1nm~2nm长度5µm～30供体0.5mg/L～10mg/L5µmol/L7.4HO-SWCNT诱导血红蛋白和肌红蛋白的变性和去折叠。[38]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021SWCNT管状外径1nm~2nm带负电低疏水性50µg/mL100µg/mL200µg/mL7.8Tau蛋白与SWCNT的结合引起蛋白质折叠和形成更紧密的结[39]MWCNT管状外径10nm~20nm带负电高疏水性50µg/mL100µg/mL200µg/mL7.8Tau蛋白和MWCNT的结合没有改变Tau蛋白的二级结构。[39]SWCNT溶菌酶管状 疏水30µg/mL6.9µmol/L 在最小波长处没有测到光谱移动，与SWCNT结合的溶菌酶接近原始状态。[40]GQDNPHSA球形1.2nm高表面积8.55µmol/L34.2µmol/L2.0µmol/L7.4随着GQD浓度的增加，HAS中α-螺旋含量降低，其他二级结构含量增加。HSA与GQDs相互作用引起其生理活性降低。[41]AgNPBHb—5nm~—18.7µmol/L37.4µmol/L74.8µmol/L0.25µg/mL7.4BHb与AgNP结合导致其发生α-β转变，引起部分去折叠。[42]Morin-AuNPBSA球形30nm~40nm还原型1.5µmol/L5.0µmol/L7.4BSA的结构是以螺旋为主。在Morin-AuNP存在下，BSA的二级结构发生了显著变化。[43]CdSNPHSA片状5nm~高表面积0µmol/L～4µmol/L4µmol/L7.4虽然人血清白蛋白与CdSNP结合后α-螺旋度下降，但其结构中仍以α-螺旋为主。[44]ZnONPToxR球形2.5nm带正电1:1（蛋白质:NP）10.0µmol/L8ToxR与ZnONP结合会导致其主要结构发生变化，二级结构大量损失。[45]ZnONP溶菌酶球形4nm~带正电—7.4ZnONP与溶菌酶表面最大缝隙[46]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:20217nm相结合，可以更大程度的保留溶菌酶的二级结构，即便在变性条件下溶菌酶也表现出酶活性。ZnONPBSA球形5nm~六方纤锌矿结构0.09µmol/L——蛋白质与ZnONP结合后，其基本结构没有变化，但α-螺旋含量下降。[47]CdTeQDNPα-胰凝乳蛋白酶球形3nm~4nm—0.6µmol/L1.6µmol/L7.029.05pH=9.05时为氢键相互作用，pH=7.02时为静电和疏水相互作用。CdTe纳米颗粒能改变α-胰凝乳蛋白酶的结构，但加入CdTe纳米颗粒24h后不同pH下，蛋白酶仍能保持高活性。[48]CdSe/ZnSQDHSA准球形4.43nm带负电2.5µmol/L5.0µmol/L7.4在QD存在下，HAS发生二级和三级结构的构象变化，在更高浓度下，变化更为明显。QD的存在削弱了HSA的生物活性。[49]谷胱甘肽-CdTeQDHSA—5nm带负电0.5µmol/L1.0µmol/L2.0µmol/L7.4QD能诱导HAS发生构象变化，进而可能改变HSA的生物活性。[50]CdTeQDHSA—2nm3.7nm4.8nmMPA包覆、GSH包覆、NAC包覆1.0µmol/L（20:1）（10:1）（5:1）（HSA:QD）7.4HSA与带负电的QD的相互作用与表面修饰无关。QD可能影响蛋白质中α-螺旋含量，而HAS的构象变化可能改变HSA的生物活性。[51]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021可用于蛋白质溶解的缓冲溶液说明C.1缓冲溶液推荐缓冲溶液的性质如表C.1所示，不推荐缓冲溶液如表C.2所示。表C.1推荐缓冲溶液的性质[4]缓冲溶液a极限波长下限（nm）10mmol/L磷酸钾，100mmol/LKF10mmol/L磷酸钾，100mmol/L(NH4)2SO410mmol/L磷酸钾，50mmol/LNa2SO410mmol/L磷酸钾，100mmol/LKCl20mmol/L磷酸钠，100mmol/LNaCl杜尔贝科磷酸盐缓冲溶液（PBS9.33mmol/L磷酸钾、136mmol/LNaCl、2.7mmol/LKCl、0.6mmol/LMgCl2、0.9mmol/LCaCl22002mmol/Lhepes,50mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,1mmol/L二硫苏糖醇20050mmol/LTris,150mmol/LNaCl,1mmol/L二硫苏糖醇,0.1mmol/LEDTA201aDMSO和甲酰胺吸收强，不能用于CD测量。表C.2不推荐缓冲溶液的性质缓冲溶液a极限波长下限（nm）六氟-2-丙醇（HFIP）200三氟乙醇（TFE）200aDMSO和甲酰胺吸收强，不能用于CD测量。C.2清洁剂使用清洁剂清洗比色皿时，建议采用以下步骤。a)比色皿清洁剂的储备溶液应按供应商的说明与去离子水混合。b)将比色皿浸入清洗溶液中，在50℃至60℃之间加热约20min。然后，比色皿用去离子水清洗几次。c)使用王水去除比色皿中的纳米颗粒。浓盐酸和浓硝酸混合发生如下反应：HNO3(aq)+3HCl(aq)→NOCl(aq)+2Clnasc(g)+2H2Od)两种酸混合后生成王水，其颜色呈金黄色。王水适用于大多数金属纳米颗粒。但是对于其他某些颗粒可根据其本身性质选择更合适的溶剂。e)将比色皿放入少量王水的溶液中沸煮约5min。f)用去离子水清洗比色皿4次。检查清洗水的pH值，并连续清洗直至清洗水的pH达到中性，确保所有王水都被冲走。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021图C.1CD测量中信噪比（S/N）随吸光度的函数关系[5]图C.2优化的蛋白质浓度随比色皿光程的函数关系[5]C.3CD实验中纳米颗粒的吸收大部分尺寸大于10nm的NOAA是非手性的，不会测量到CD信号[52]。当纳米颗粒与手性分子或手性生物分子偶联后，其可能产生诱导的CD信号[53]。尺寸小于10nm的纳米材料也可能会产生CD信号，如金属结构的表面等离激元共振可能会在可见光区产生CD信号。另外，纳米材料团簇（0.5nm~2nm）可转变为手性体进而产生CD信号[54]。C.4缓冲溶液在远紫外区的吸收参加表C.3。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021表C.3各种盐和缓冲溶液中的物质在远紫外的吸收[55]化合物pH以上无吸收10mmol/L溶液在1mm比色皿中的吸光度210nm200nm190nm180nmNaClO4170nm0.000.000.000.00NaF,KF170nm0.000.000.000.00硼酸180nm0.000.000.000.00NaCl205nm0.000.02>0.50>0.50Na2HPO4210nm0.000.050.3>0.50醋酸钠220nm0.030.17>0.50>0.50甘氨酸220nm0.03010>0.50>0.50二乙胺240nm0.40>0.50>0.50>0.50NaOH230nm>0.50>2.00>2.00>2.00硼酸，NaOH200nm0.000.000.090.30Tricine8.5230nm0.220.44>0.50>0.50Tris8.0220nm0.020.130.24>0.50HEPES7.5230nm0.370.50>0.50>0.50PIPES7.0230nm0.200.490.29>0.50MOPS7.0230nm0.100.340.28>0.50MES6.0230nm0.070.290.29>0.50二甲基胂酸7.0210nm0.010.200.22C.5样品制备控制和采集高质量光谱使用CD时：a)在CD测量前后，应对比色皿中的缓冲溶液和样品进行肉眼观测：1)是否存在气泡（样品在测量过程中会排出气体）？2)样品在溶液中是否稳定？3)样品是否散射过强？b)应检查缓冲溶液是否存在CD信号。如果存在，可从样品中扣除对应的的缓存溶液CD信号。c)考虑比色皿是否可以重复放置在仪器中。如果不是，缓冲溶液和样品的光谱可能出现垂直偏移。在250nm～260nm区域的CD信号可能会趋于0mdeg。d)考虑样品是否在测量光束中发生光解。记录重复测量，仔细检查复现性。样品光解可能引起信号强度的降低。e)当将仪器设定为某个扫描速率时，可能偶尔出现过度平滑或失真的数据。仪器的用户手册会说明如何选择合适的扫描速率。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021CD测量中的单位转换表D.1CD测量中的单位转换初始单位吸光度a毫吸光度b摩尔消光c度d毫度e摩尔椭圆率f(A)AA×1000A×M/(C×L)A×32.98A×32980A×M×3298/(C×L)(mA)mA/1000mAA×M/(C×L×mA×0.03298mA×32.98mA×M×3298/(C×L)(ε)ε×C×L/Mε×C×L×1000/Mεε×C×L×32.98/Mε×C×L×32980/Mε×3298(°)°/32.98°/0.03298m°×M/(C×L×32.98)°°×1000°×M×100/(C×L)(m°)m°/32980m°/32.98m°×M/(C×L×32980)m°/1000m°m°×M/(10×C×L)[θ]×C×L/(3298×M)[θ]×C×L/(3.298×M)[θ]/3298[θ]×C×L/(100×M)[θ]×C×L×10/Ma单位为吸光度（A）。c单位为A×L/mol×cm。d单位为度(°)。e单位为毫度(m°)。f单位为度×cm2/dmol。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021计算样品的浓度范围在蛋白质溶液中，纳米颗粒的合适浓度应通过在其表面形成单层蛋白质所需的蛋白质数量来计算。选择的纳米颗粒浓度应确保在混合体系中纳米颗粒的总表面积理论上足以容纳体系中所有的蛋白质。纳米颗粒悬浮液在缓冲溶液中的稳定性通过DLS进行测试[16]。表面位点浓度可通过颗粒的表面位点数乘以1L溶液中颗粒的数量并除以阿伏伽德罗常数（NA=6.022×1023mol-1）进行简单地计算，如公式E.1所示：C表面位点浓度…………………GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021蛋白质二级结构的评估方法表F.1利用CD光谱评估二级结构的各种方法的可靠性[21]方法失效螺旋校正系数反平行式平行式β-折叠转角和其他RMSDRMSD校正系数RMSD校正系数RMSD校正系数RMSD校正系数BeStSel—0.0380.990.0500.980.0320.970.0390.990.0330.95VARSLC50.0890.970.1550.620.860-0.080.1330.730.1300.74LINCOMB—0.1190.910.2140.450.1980.590.2300.510.2320.59CDNN 0.0830.970.830.0760.910.1020.890.1150.81SELCON—0.1470.860.820.0770.73CONTIN20.0950.950.0680.960.0740.73CDSSTR—0.2010.760.1390.750.0990.71K2D—0.1980.840.1520.790.1530.55K2D2—0.2220.700.1620.710.0880.68K2D3 0.1360.870.1840.640.1430.65CAPITO—0.2600.570.1610.850.1470.70GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021利用UV-CD评估蛋白质二级结构的典型数据表G.1利用UV-CD评估蛋白质二级结构的典型数据波长（nm）Deltaepsilon波长（nm）Deltaepsilon波长（nm）Deltaepsilon2002.7847217-2.2639234-0.034622013.1755218-2.28962350.031372023.3261219-2.3112360.098432033.2518220-2.27062372042.9984221-2.22052380.155722052.5517222-2.08262390.192472061.9434223-1.90362400.202172071.2864224-1.72892410.21082080.6035225-1.60522420.21834209-0.04016226-1.46752430.18156210-0.5339227-1.31682440.16533211-0.92011228-1.1392450.1329212-1.2422229-0.911572460.11236213-1.5534230-0.667892470.1199214-1.8005231-0.479482480.14905215-2.053232-0.291122490.13607216-2.1861233-0.129852500.1015GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021参考文献[1]TADEPALLIS,WANGZ,SLOCIKJ,NAIKRR,SINGAMANENIS.Effectofsizeandcurvatureontheenzymeactivityofbionanoconjugates.Nanoscale.2017,9,pp.15666–15672[2]RAMIREZ-ALVARADOM,KELLYJW,DOBSONCM.ProteinMisfoldingDiseases:CurrentandEmergingPrinciplesandTherapies.Wiley,2010[3]RAHMANM,LAURENTS,TAWILN,YAHIAL,MAHMOUDIM.Protein-nanoparticleinteractions.Springer,2013[4]GREENFIELDNJ.Usingcirculardichroismspectratoestimateproteinsecondarystructure.NatureProtocols.2006,1,pp.2876–2890[5]FASMANGD.Circulardichroismandtheconformationalanalysisofbiomolecules:SpringerScience&BusinessMedia,2013[6]HERRONJN,JISKOOTW,CROMMELINDJ.Physicalmethodstocharacterizepharmaceuticalproteins.SpringerScience&BusinessMedia,2013[7]WALLACEBA,JANESRW.Synchrotronradiationcirculardichroismspectroscopyofproteins:secondarystructure,foldrecognitionandstructuralgenomics.CurrentOpinioninChemicalBiology2001,5,pp.567–571[8]NGUYENVH,LEEBJ.Proteincorona:anewapproachfornanomedicinedesign.IntJNanomedicine2017,12,pp.3137–3151[9]ZEINABADHA,KACHOOEIE,SABOURYAA,KOSTOVAI,ATTARF,VAEZZADEHM,FALAHATIM.Thermodynamicandconformationalchangesofproteintowardinteractionwithnanoparticles:aspectroscopicoverview.RSCAdvances2016,6,pp.105903–105919[10]TREUELL,MALISSEKM,GEBAUERJS,ZELLNERR.TheInfluenceofSurfaceCompositionofNanoparticlesontheirInteractionswithSerumAlbumin.ChemPhysChem2010,11,pp.3093–3099[11]CHENR,CHOUDHARYP,SCHURRRN,BHATTACHARYAP,BROWNJM,CHUNKP.Interactionoflipidvesiclewithsilvernanoparticle-serumalbuminproteincorona.ApplPhysLett2012,100,pp.13703–137034[12]LAERAS,CECCONEG,ROSSIF,GILLILANDD,HUSSAINR,SILIGARDIG,CALZOLAIL.Measuringproteinstructureandstabilityofprotein–nanoparticlesystemswithsynchrotronradiationcirculardichroism.NanoLetters2011,11,pp.4480–4484[13]HUSSAINR,SILIGARDIG.CharacterisationofConformationalandLigandBindingPropertiesofMembraneProteinsUsingSynchrotronRadiationCircularDichroism(SRCD).In:MoraesIed,TheNextGenerationinMembraneProteinStructureDetermination.Cham:SpringerInternationalPublishing,2016,pp.43–59[14]DENGZJ,LIANGM,MONTEIROM,TOTHI,MINCHINRF.Nanoparticle-inducedunfoldingoffibrinogenpromotesMac-1receptoractivationandinflammation.NatNano2011,6,pp.39–44[15]TREUELL,MALISSEKM.Interactionsofnanoparticleswithproteins:Determinationofequilibriumconstants.In:CellularandSubcellularNanotechnology.Springer,2013,pp.225–235[16]ISO22412,Particlesizeanalysis—Dynamiclightscattering(DLS)[17]WHITMOREL,WOOLLETTB,MILESAJ,KLOSEDP,JANESRW,WALLACEBA.PCDDB:theproteincirculardichroismdatabank,arepositoryforcirculardichroismspectralandmetadata.NucleicAcidsRes2011,39,pp.D480–D486[18]SREERAMAN.CDPro,2017./sreeram/CDPro/GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021[19]WOOLLETTB,WHITMOREL,JANESRW,WALLACEBA.ValiDichro:awebsiteforvalidatingandqualitycontrolofproteincirculardichroismspectra.NucleicAcidRes2013,41,pp.W417–W421[20]OMICtools.Circulardichroism(CD)spectroscopydataanalysissoftwaretools,2017[21]MICSONAIA,WIENF,KERNYAL,LEEY-H,GOTOY,RÉFRÉGIERSM,KARDOSJ.Accuratesecondarystructurepredictionandfoldrecognitionforcirculardichroismspectroscopy.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2015,112,pp.E3095–E3103[22]MICSONAIA,WIENF,BULYAKIE,KUNJ,MOUSSONGE,LEEYH,GOTOY,REFREGIERSM,KARDOSJ.BeStSel:awebserverforaccurateproteinsecondarystructurepredictionandfoldrecognitionfromthecirculardichroismspectra.NucleicAcidsRes2018,46,pp.W315–W322[23]LICH,NGUYENX,NARHIL,CHEMMALILL,TOWERSE,MUZAMMILS,GABRIELSONJ,JIANGY.Applicationsofcirculardichroism(CD)forstructuralanalysisofproteins:qualificationofnear‐andfar‐UVCDforproteinhigherorderstructuralanalysis.JPharmSci2011,100,pp.4642–4654[24]RAVIJ,RAKOWSKAPD,GARFAGNINIT,BARONB,CHARLETP,JONESC,MILEVS,LORENZJD,PLUSQUELLICD,WIENF.Internationalcomparabilityinspectroscopicmeasurementsofproteinstructurebycirculardichroism:CCQM-P59.1.Metrologia2010,47,pp.631[25]VERTEGELAA,SIEGELRW,DORDICKJS.Silicananoparticlesizeinfluencesthestructureandenzymaticactivityofadsorbedlysozyme.Langmuir2004,20,pp.6800–6807[26]SHANGW,NUFFERJH,MUÑIZ‐PAPANDREAVA,COLONW,SIEGELRW,DORDICKJS.Cytochromeconsilicananoparticles:influenceofnanoparticlesizeonproteinstructure,stability,andactivity.Small2009,5,pp.470–476[27]JIANGX,JIANGJ,JINY,WANGE,DONGS.EffectofColloidalGoldSizeontheConformationalChangesofAdsorbedCytochromec:ProbingbyCircularDichroism,UV-Visible,andInfraredSpectroscopy.B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