实验二 淀粉酶活性的测定

Pleasebequiet,上课了！！6/30/2024生物化学实验淀粉酶活性的测定实验二学时：36/30/2024生物化学实验

1、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定的原理和方法。

2、掌握α，β-两种淀粉酶的理化特性。一、实验目的：6/30/2024生物化学实验二、实验原理酶（enzyme）是具有高效性与专一性的生物催化剂（biologicalcatalyst）。

绝大多数酶的化学本质是蛋白质。特点：1、酶具有高效性（highcatalyticpower）2、酶具有专一性（specifity）6/30/2024生物化学实验二、实验原理:

酶活性（emzymeactivity）

指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下酶促反应速度来表示，酶促反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。6/30/2024生物化学实验

二、实验原理:

淀粉是植物生长期间以淀粉粒形式存在于细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量丰富。

天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。多数淀粉含直链与支链淀粉的比例(20％－25％)：(75％－80％)。6/30/2024生物化学实验NRERE直链淀粉直链淀粉的螺旋结构0.8nm1.4nm6个残基RENRE

(1-6)分支点支链淀粉或糖原分子示意图支链淀粉或糖原分支点的结构β-淀粉酶断裂产生游离麦芽糖6/30/2024生物化学实验RENRE

(1-6)分支点支链淀粉或糖原分子示意图β-淀粉酶断裂产生游离麦芽糖淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。6/30/2024生物化学实验植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。

α-淀粉酶耐热不耐酸，70℃加热15min仍保持活性,pH＜3.6时钝化。

β-淀粉酶耐酸不耐热，70℃加热15min则钝化。据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。6/30/2024生物化学实验

本实验采用加热法钝化β-淀粉酶，测定α-淀粉酶的活性。具体方法是利用3,5-二硝基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成的麦芽糖的含量，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。6/30/2024生物化学实验

在碱性，加热条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)

反应，还原糖被氧化成糖酸，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色,A540)3,5-二硝基水杨酸

(DNS)6/30/2024生物化学实验1、实验材料：萌发的小麦种子2、仪器：(1)可见分光光度计

(2)恒温水浴锅

(3)离心机

(4)刻度试管3、试剂：(1)0.4MNaOH；

(2)1%淀粉；

(3)3,5-二硝基水杨酸；

(4)麦芽糖标准溶液(1mg/ml)。三、实验材料、仪器和试剂：6/30/2024生物化学实验四、实验步骤1.麦芽糖标准曲线的制作取5支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：表1麦芽糖标准曲线制作试剂管号12345麦芽糖标准液（mL）00.51.01.52.0蒸馏水（mL）2.01.51.00.50麦芽糖浓度（mg/ml）00.250.50.751.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.0沸水浴5min，冷却，稀释至20ml测定540nm处吸光度吸光度值06/30/2024生物化学实验

摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。6/30/2024生物化学实验2、酶液的制备：称取2.0g萌发的小麦种子→于研钵中，加2ml水及少许石英砂，研成匀浆→转入离心管→用6ml蒸馏水分三次洗涤研钵→均转入离心管→用玻璃棒搅动20min→等重→4000r/min离心10min→上清夜转入100ml容量瓶→定容，此提取液即为淀粉酶液。6/30/2024生物化学实验3、α-淀粉酶活性的测定：

（1）取两支试管一支对照，一支测定→各加淀粉酶液1ml→70℃准确加热15min→冷却→向对照管加4ml0.4MNaOH，终止酶活性；（2）测定管和对照管于40℃水浴15min→均加入2ml40℃预热的淀粉→立即40℃水浴保温5min→取出后迅速向测定管加入4ml0.4MNaOH；6/30/2024生物化学实验（3）取对照管和测定管中溶液各2ml,分别加入到刻度试管中→各加2ml3,5-二硝基水杨酸→沸水浴5min→冷却→稀释至20ml刻度→混匀→以制作麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调“零”，测定540nm处吸光度→记录结果。6/30/2024生物化学实验酶液钝化β-淀粉酶钝化酶活性酶促反应终止酶促反应麦芽糖含量测定记录结果对照管（A1）1ml70℃15min4mlNaOH2ml淀粉40℃5min分别取2ml溶液+2ml3,5-二硝基水杨酸沸水浴5min冷却后稀释至20ml混匀测定540nm处吸光度测定管（A2）1ml70℃15min2ml淀粉40℃5min4ml

NaOHα-淀粉酶活性的测定6/30/2024生物化学实验4、淀粉酶总活力的测定

（1）取两支试管一支对照，一支测定→各加酶液1ml，向对照管加4ml0.4MNaOH，以钝化酶的活性；（2）测定管和对照管于40℃水浴5min→均加入2ml40℃预热的淀粉→立即40℃水浴保温5min→取出后迅速向测定管加入4ml0.4MNaOH；6/30/2024生物化学实验（3）取对照管和测定管中溶液各2ml，分别加入到刻度试管中→各加2ml3,5-二硝基水杨酸→沸水浴5min→冷却→稀释至20ml刻度→混匀→以制作麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调“零”，测定540nm处吸光度→记录结果。6/30/2024生物化学实验酶液钝化酶活性酶促反应终止酶促反应麦芽糖含量测定记录结果对照管(B1)1ml4mlNaOH2ml淀粉40℃5min分别取2ml溶液+2ml3,5-二硝基水杨酸沸水浴5min冷却后稀释至20ml混匀测定540nm处吸光度测定管(B2)1ml2ml淀粉40℃5min4mlNaOH淀粉酶总活力的测定6/30/2024生物化学实验

在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg/ml），按下列公式计算α-淀粉酶和β-淀粉酶的活力。α-淀粉酶活力（麦芽糖毫克数/样品鲜重·分钟）

=（A2-A1）×V×D÷样品鲜重÷时间其中：A2：为α-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）（测定试管中麦芽糖浓度）；

A1：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）。

V：为酶促反应体积；

D：为稀释倍数。五、实验结果与计算：6/30/2024生物化学实验（α＋β）淀粉酶总活力（麦芽糖毫克数/样品鲜重·分钟）

=（B2-B1）×V×D÷样品鲜重÷时间B2：为（α+β）淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）；B1：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）；V：为酶促反应