化学毒物的致突变作用

化学毒物的致突变作用

遗传毒理学－－研究化学物质及其它环境因素对机体遗传机构的毒作用遗传毒理学的目的是检测在亚毒性暴露水平即能特异性地引起基因损伤，造成机体遗传特性改变的物质，研究其毒性作用特点及对人类的潜在影响。遗传毒理学主要研究☆致突变的作用机制☆应用检测系统发现和探究致突变物☆提出评价致突变物对健康危害的方法。内容第一节概述

一、基本概念

外源化学物及其它环境因素如能损伤机体的遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱变物，也称遗传毒物。

外源化学物及其它环境因素能引起细胞核中的遗传物质发生变化，而且这种改变随同细胞分裂过程而传递的过程称为致突变作用－－突变的发生及其过程即称为致突变作用。

基因突变染色体畸变光镜观察二、遗传学基础

（一）DNA与基因结构：核苷酸

（二）染色质与染色体（三）体细胞与生殖细胞（四）细胞周期与细胞的分裂第二节化学毒物的致突变类型

基因突变染色体畸变染色体数目的改变

一、基因突变

基因突变亦称点突变，是组成一个染色体的一个或几个基因中DNA序列发生的变化。化学致突物造成的DNA损伤，在DNA复制过程中转变为碱基排列顺序的变化，导致基因突变。

（一）碱基置换

碱基置换是某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。

转换/颠换

遗传密码子具有兼并性错义突变同义突变无义突变（二）移码

移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。

移码突变往往会使基因产物发生大的改变，引起明显的表型效应，常出现致死性突变。

整码突变

又称为密码子的插入或缺失，指在DNA链中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子，此时基因产物多肽链中会增加或减少一个或几个氨基酸，此部位之后的氨基酸序列无改变。补充（三）大段损伤(片断突变)

指基因中某些小片段核苷酸序列发生改变，这种改变有时可跨越两个或数个基因，涉及数以千计的核苷酸。主要包括核苷酸片段的缺失、重复、重组及重排等。

根据突变后基因产物功能的改变，基因突变可分为正向突变及回复突变。正向突变(forwardmutation)是导致基因产物正常功能丧失的突变，回复突变(reversemutation)则指使基因产物的功能恢复的突变。补充

二、染色体畸变

指染色体结构异常，它是指遗传物质大的改变，是由染色体或染色单体断裂所致。当断端不发生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体结构异常。

光镜检查适当细胞有丝分裂中期相

染色体结构改变的基础是DNA链的断裂，所以把能引起染色体畸变的外源化学物称为断裂剂。

染色单体型畸变——拟紫外线断裂剂染色体型畸变——拟放射性断裂剂

产生何种畸变，取决于损伤发生在DNA复制前，还是复制后。

染色体结构异常的类型：（1）倒位：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180°再重接，因其位置被颠倒，故称倒位。（2）缺失：染色体丢失一个片断。结果保留在核中的有着丝粒节段缺少了部分遗传物质。（3）重复：在一套染色体里，一个染色体片断出现不止一次。（4）易位：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。

裂隙和断裂、环状染色体等

裂隙：在一条染色单体或两条染色单体上出现无染色质的区域，但该区域的大小等于或小于染色单体的宽度断裂：同裂隙，但无染色质区域的大小大于染色单体的宽度。环状染色体：染色体两条臂均发生断裂后，带有着丝粒部分的两端连接起来形成环状。通常伴有一对无着丝点的断片。补充微小体：中间缺失形成的断片有时很小，成圆点状。无着丝点环：无着丝粒的染色体或染色单体断片连在一起呈环状。

图2染色体畸变的常见类型（CHO细胞）a.染色单体断裂

b.三辐射体c.染色体断片

d.双着丝点染色体e.环状染色体

f.无着丝点断片

以上的畸变类型中，有些是稳定的畸变，如小的缺失、重复、倒位、平衡易位等，它们可通过细胞分裂而传递下去，在细胞群中维持。而染色体断裂形成的无着丝点断片、无着丝点染色体环、双着丝点染色体及其他不平衡易位则是不稳定的，由于有遗传物质大范围的损失或对有丝分裂的妨碍，往往会造成细胞死亡。补充三、基因组突变基因组突变指基因组中染色体数目的改变，也称为染色体数目畸变。以动物正常体细胞染色体数目2n为标准，则染色体数目异常可表现为

整倍性畸变非整倍性畸变表1

不同物种动物的染色体数目物种体细胞(2n)性细胞(n)物种体细胞(2n)性细胞(n)人4623兔4422大鼠4221猫3819小鼠4020狗7839第三节致突变作用的机理及后果

有些致突变物以DNA为靶，诱导基因突变和染色体畸变。而有些致突变物则不以DNA为靶，常以有丝分裂和减数分裂的成分，如以纺锤丝为靶，诱导染色体数目的异常。一、以DNA为靶的损伤机理

（一）DNA加合物形成

许多化学诱变剂或其活化产物是亲电子物，可与细胞内DNA、RNA和蛋白质等大分子亲核物质通过共价键，形成稳定的复合物，即加合物。

烷化剂图2O6鸟嘌呤烷化后的碱基配对（二）平面大分子嵌入DNA链

有些化合物能以非共价结合的静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间，称嵌入剂。

多环的平面结构（尤其是三环结构）易于嵌入造成移码突变

9-氨基吖啶；吖啶芥ICR-191

（三）DNA－蛋白质交联物形成

“共价结合”

DNA链内、链间或DNA与蛋白质之间发生交联，引起DNA-蛋白质交联物的形成烷化剂、苯并（a）芘、砷化物、醛类化合物及一些重金属（如Ni，Cr）等

（四）改变或破坏碱基的化学结构

对碱基产生氧化作用或在机体内形成有机过氧化物/自由基来破坏嘌呤的化学结构，从而破坏或改变其结构，有时还引起链断裂。主要改变核酸中核苷酸的化学组成，其作用与DNA复制无关亚硝酸根；甲醛、氧基甲酸乙酯（五）碱基类似物取代

碱基类似物在细胞周期的DNA合成期（S期）能与正常的碱基竞争，取代其位置。结果常造成错误配对，即发生碱基置换。

5－溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu)取代胸腺嘧啶，2－氨基嘌呤(2-AP)取代鸟嘌呤

图35-BrU的碱基配对（六）二聚体的形成

当细胞或机体受到紫外线刺激，会使DNA发生化学变化，主要产生环丁烷嘧啶二聚体和（4－6）光产物

二、不以DNA为靶的损伤机理

（一）对DNA合成和修复有关的酶系统作用（二）对纺锤体的毒作用

(1)与微管蛋白二聚体结合

(2)与微管上的巯基结合

(3)破坏已组装的微管

(4)妨碍中心粒移动

(5)其它作用三、突变的后果

主要取决于其所作用的靶细胞类型

体细胞突变：仅能影响接触致突变物的个体，不影响下一代。后果有肿瘤、畸形、动脉粥样硬化、糖尿病及衰老等。生殖细胞突变：可影响下一代。造成显性致死或可发生遗传性改变，进而可能影响人类的基因，增加人类的遗传负荷。

化学致突变物引起生殖细胞的基因突变对人类的影响，按其严重程度可分为：①对机体无影响；②导致对健康无影响的正常人体生化组成的遗传学变异；③导致遗传易感性的改变；④导致遗传性疾病，包括多种分子病和遗传性代谢缺陷病等；⑤致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。第四节致突变作用的研究方法

致突变试验旨在评定外源化学物对生殖细胞及体细胞的致突变性，对致癌、致畸和遗传危害的潜在可能作出初步评价。

所用的指示生物涉及到病毒、细菌、霉菌、昆虫、植物、体外培养的哺乳动物细胞和哺乳动物等。

一、常用的致突变试验

（一）细菌回复突变试验（Ames试验）以营养缺陷型的突变体为指示生物，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变发生改变的体外试验。

常用的菌株：组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌

——Ames试验鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验

GB15193.4－2003色氨酸营养缺陷型大肠杆菌（E.coli）

鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株在某个调控组氨酸合成的基因发生了点突变，丧失合成组氨酸的能力，突变的菌株必须依赖外源性组氨酸才能生长。而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长成可见的菌落。通过选择性培养基上回变菌落数的变化来判定受试物是否有致突变性。

原理我国普遍采用四种标准测试菌株：

TA97，TA98，TA100，TA102；必要时可增加TA1535，TA1537或TA104任一菌株。代谢活化系统：S9混合液

平板掺入法Ames试验的优点：方法灵敏，检出率高；

简便、易行缺点：微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。Ames致突变试验和大鼠致癌试验有较好的一致性。

（二）哺乳动物细胞基因突变试验

哺乳动物细胞基因突变试验是体外培养细胞的基因正向突变试验。正向突变试验是利用培养的哺乳动物细胞系，观察特定基因座位上是否诱变产生突变体的试验。常用的试验方法有小鼠淋巴瘤（IS178y）细胞胸苷激酶位点（tK）突变检测、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及中国仓鼠成纤维细胞（V79）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点（hgprt）突变检测和中国仓鼠卵巢细胞的AS52细胞株黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点(gpt)突变检测。体外哺乳类细胞（V79/HGPRT）基因突变试验

GB15193.12－2003正向突变试验可检测座位内的碱基置换、缺失、移码和重排等点突变。（三）微核试验

微核与染色体损伤有关。经致突变作用后，染色体或染色单体的无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞有丝分裂的后期不能进入子代细胞的细胞核中，而在间期的子代细胞浆内形成一个或几个规则的次核，因比主核小，故称微核。

在细胞质中微核来源有二：一是断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；二是对有丝分裂过程有毒的化学物作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被遗留在细胞浆中。通过观察受试物能否产生微核，并检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂的试验。体内试验指示生物：植物细胞（如紫露草花粉母细胞、蚕豆根尖等）、哺乳类动物细胞（如骨髓细胞、肝细胞、脾细胞、淋巴细胞、红细胞等）、非哺乳类动物细胞（如鱼红细胞、蟾蜍红细胞等）。应用最多的是啮齿类动物骨髓多染红细胞（PCE)微核试验图5

小鼠骨髓多染红细胞微核的形成图6嗜多色性红细胞

图7微核

体外实验：中国仓鼠肺细胞（CHL），中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及中国仓鼠成纤维细胞（V79）等细胞进行试验的体外微核试验法，人周围血微核试验法、双核细胞法、免疫荧光染色法和荧光原位杂交法（四）染色体畸变试验

制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下观察染色体形态结构和数目的改变。染色体结构异常主要可观察到裂隙、断裂、断片、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环及各种辐射体等。

体内染色体畸变试验主要有啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验及啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验。

体外染色体畸变试验常用的分析细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、中国仓鼠肺（CHL）和V79细胞株及外周血淋巴细胞等。

比较研究显示，在检测断裂剂方面微核试验和染色体畸变试验的结果有很好的相关，不仅在质(是否为断裂剂)上，而且在量上(可检测的最小致突变作用剂量)也是如此，所以，在断裂剂检测时二者都可使用。比较（五）显性致死试验

体内试验，用于检测整体哺乳动物生殖细胞的遗传性损伤。显性致死试验以胚胎死亡为观察终点，可检出受试物对生殖细胞的染色体损伤作用。即单纯染色体断裂所导致的大缺失或重复；或者因染色体重排所形成的不平衡染色体分离或不分离，即非整倍型畸形（非整倍体）。

一般采用仅对雄性动物染毒，然后与未处理的雌性动物交配，观察一个精子发育周期中各个阶段雌鼠胚胎早期死亡发生率的变化，进而判断受试物有无对雄性生殖系统的损害及损害发生的敏感阶段，是否具有致突变作用。（六）程序外DNA合成试验

正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期按固定程序进行DNA复制合成。称为程序性DNA合成。当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期（S期）以外的其它时期，称为程序外DNA合成。本试验可以利用放射自显影法或液体闪烁计数法显示DNA修复合成。常用的细胞系统有大鼠原代培养肝细胞、外周血淋巴细胞、人成纤维细胞、Hela细胞及人羊膜细胞FL株等。一般使用不是处于正在增殖状态的细胞进行试验。

（七）姐妹染色单体交换试验

姐妹染色单体交换（SCE）是染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换，其频率可能与DNA的断裂和重接有关，故可间接提示DNA的损伤。观察方法：采用姐妹染色单体的差别染色法，5－溴脱氧尿嘧啶核苷

图6姐妹染色单体区别染色原理

SCE试验可进行体外试验，也可进行体内试验。体外试验可用细胞株或人外周血淋巴细胞，体内试验可用骨髓细胞或睾丸生殖细胞进行。

（八）果蝇伴性隐性致死试验

果蝇伴性隐性致死试验是利用隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传的特征而进行的试验。试验所用的果蝇是黑腹果蝇

给予雄果蝇（红色圆眼，正常蝇）受试物后，如发生点突变、小缺失、重组等各类基因突变的隐性致死效应，则将传给F1代雌蝇，再通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇。由于x染色体上的隐性基因在F1代雌蝇为杂合子，不能表达，而在F2代雄蝇为半合子，使位于x染色体上的隐性基因在半合型雄蝇中表现出来。即由于致死基因突变不出现，会有明显标记（如眼睛的形状和色泽）的野生型雄蝇出现。（九）单细胞凝胶电泳试验

简便而又快速测试完整细胞DNA链断裂

（十）荧光原位杂交技术在保持组织、细胞或染色体原有形态结构基础上，对其内部特殊核苷酸顺序进行检测及定位的分子生物学新技术。该法用生物荧光来标记的各类DNA和RNA进行原位杂交，即可使被观察的特定DNA序列显现荧光。

FISH在遗传毒理学中主要有以下两个方面的应用：一是对染色体精细结构的分析；另一是对非整倍性畸变（非整倍体）的检测。（十一）转基因动物致突变检测系统利用穿梭载体于原核和真核之间往返转移，并带可回收靶基因载体的转基因小鼠提供哺乳动物体内基因。在动物个体水平研究突变的器官、组织的特异性，包括生殖细胞；并可比较容易地从动物基因组中重新回收导入的基因，进行进一步的序列分析。

二、应注意的一些问题

（一）体外试验的活化系统——检测直接及间接诱变剂：

完整的哺乳动物细胞

，S9混合液（二）阳性和阴性对照组的设立阳性对照：①证明试验方法的可靠；②验证试验的重复性；③验证完成技术和鉴定致突变物的能力。

阴性对照：获得试验的基础数据

（三）致突变试验结果的判定各种致突变试验都有其特定的遗传学终点，但在试验结束后均会面临二个所得的数据表示阳性结果或表示阴性结果的问题。（三）致突变试验结果的判定

在评定试验结果前，首先应检查试验的质量控制情况。

1.试验程序与操作的正确性，

2.在体外试验中是否存在体内并不存在的某些因素:如过高或过低的pH、渗透压以及代谢活化系统浓度是否偏离细胞或细菌的生理条件。

3.还有：①阴性和阳性对照组的设立；②盲法观察；③资料的统计学分析；④试验结果的重复性等。

（三）致突变试验结果的判定体外试验的阴性结果：应特别注意提供的代谢活化系统对于受试物的活化是否适合和充足。体内试验的阴性结果：特别是当体外试验已显示有致突变性时，应考虑受试物是否未能到达靶部位。综合分析试验组的效应比阴性对照组是否明显增加、是否具有剂量一反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加。对于弱的或可疑的效应结果是否具有可重复性等，还应对试验的条件（如体内体外的差异）进行分析。

第五节遗传毒理学试验在预测致癌性及遗传危害性中的价值

遗传毒理学试验的主要目的是研究外源化学物引起人类生殖细胞的突变并传递给后代的可能性；另外基于体细胞突变与肿瘤有关的认识，也可用于外源化学物潜在致癌性的预测。补充(引自BrusickD．GeneticToxicologyinHayesAW．PrinciplesandMethodsofToxicology,3rded，RavenPress，1994，553)

在用遗传毒理学试验预测对人类的危害时，一般认为体内试验的权重大于体外试验、真核生物的试验大于原核生物、哺乳动物的试验大于非哺乳动物、对于预测可遗传的效应，生殖细胞大于体细胞。

环境因素对人类致癌性及遗传危害性的直接证据来自人群的流行病学资料。

第六节遗传毒理学试验的组合应用

为了尽可能防止在预测外源化学物致癌性及遗传危害性中的假阴性结果，需要成组应用遗传毒理学试验。组合试验应用的越多，假阴性率会下降，但假阳性率会增加，方法过多也会使费用增加，时间拖延。补充

对于外源化学物致突变性的初步判断可通过检测其致基因突变及染色体损伤的能力。对于这些终点的检测需要分别的遗传毒理学试验，所以至少需要2个试验。通常是细菌回复突变试验和培养细胞的染色体畸变试验。

遗传毒理学试验成组应用试验组合的原则为：①应包括多个遗传学终点。现在还没有一种试验能同时测出基因突变、染色体畸变、非整倍体和DNA损伤等。②试验指示生物包括若干进化阶段的物种，包括原核生物和真核生物。③应包括体外试验和体内试验。一般认为，体外试验检测受试物本身是否具有遗传毒性，体内试验可确定受试物能否在体内显示其遗传毒性。④应