DB63T 2291-2024 青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范

ICS65.020.20CCSB21

DB63青 海 省 地 方 标 准DB63/T2291—2024青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范2024-6-19发布 2024-7-25实施青海省市场监督管理局 发布DB63/T2291DB63/T2291—2024前 言本文件按照GB/T1.1─2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青海省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务中心、青海省乡村产业发展指导中心。本文件由青海省农业农村厅监督实施。I标准名称范围（Hordeumvulgarevar.nudumHook.f.）DNADNA本文件适用于青稞育成品种DNA指纹图谱的采集，并对照鉴定。（GB/T3543.2 作种检验程扦样GB/T3543.4 作种检验程发试GB4404.1 粮作种子第1分禾类GB/T6682 分实室水规和验法GB/T19495.3 GB/T30988 DNAGB/T34265 Sanger下列术语和定义适用于本文件。3.1SNP标记基于单核苷酸多态性的分子标记。3.2DNA指纹图谱通过DNA检测技术，获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹。缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicAcid）SNP：单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism）1PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）见附录A。超纯水符合GB/T6682的要求，所用试剂为分析纯。见附录B。见附录C。扦样GB4404.1GB/T3543.2发芽按照GB/T3543.4的规定进行发芽，发芽的籽粒数需大于等于50粒。随机选取三叶一心植株10株，采取叶片混样进行样品制备。DNADNA按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。DNA按照GB/T30988中的DNA纯度、浓度测试进行DNA质量检测。PCR将附录C中引物稀释至10µmol/L，DNA浓度稀释至100ng/μl~200ng/μl。反应体系为25µl,包含10×PCR2μl，2.5mmol/LdNTP1.6μl，10µmol/L0.5μl，10µmol/Lμl，TaqDNA0.2μl18.2μl，样品DNA2μl。294℃预变性4min；95℃变性30s，不同引物按照附录C设置退火温度退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。按照GB/T30988GB/T34265育成品种DNACSNPDNA参照附录D中青稞育成品种的DNA图谱，判断所鉴定的品种是否为相同或不同的品种。3附 录 A（规范性）主要仪器设备及试剂PCR（0.01（0.0001g、μl、10μl、100μl、1000μl）、微波炉、量筒、电泳装置、电泳仪、凝胶成像系统或紫外乙二胺四乙酸二纳、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、10×PCR反应缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸、TaqDNA聚合酶、琼脂糖、溴酚蓝、硼酸、二甲苯青、甘油、二甲基腈蓝FF、溴化乙锭。4附 录 B（规范性）溶液配制DNA0.5ol/A（H.0溶液称取9.305g的EDTA-Na2·2H2O，加40mL0.8g～1.1gNaOHpH至8.0，50ml103.4kPa（121℃）20min1ol/rs-C（H80）称取6.06g的Tris，加40mL的超纯水，充分溶解。用1.8mL～2.2mL的浓HCl（36%~38%）准确调节pH至8.0，定容至50ml。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。DNA称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8g和氯化钠32.7g，依次加入10mLTris-HCl溶液（pH8.0）（见B.1.2），4mLEDTA溶液（pH8.0）（见B.1.1），加超纯水充分溶解后定容至400mL。灭菌温度和时间同B.1.1，4℃保存。10DNA取10mL1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）（见B.1.2）和2mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）（见B.1.1）100mlB.1.1，5×TBE称取54gTris，27.5g20ml0.5mol/LEDTA见B.1.1）1L。1×TBE6×称取EDTA8.7672g，二甲苯腈蓝FF0.5g，溴酚蓝0.5g，加入360ml甘油，调节PH至7.0，再用超纯水定容至1L，磁力搅拌溶解，4℃保存。10mg/ml（EB）在100ml超纯水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室温保存。5附 录 C（）SNPSNP标记信息见表C.1。表C.1 用于建稞成种DNA纹的SNP标物信息标记染色体位置(bp)退火温度（℃）引物序列（5’-3’）SNP17H61021878858F:GCGAGGTGGACGATGTGGR:GTGAGTTTGACGAGGTTCTGCSNP27H7932520158F:CAGTCCACGTCCCACCAAAR:TGCAAGCGTCGTCATCCTCSNP37H552552555F:CCGCAGTATCATTCAGTCCR:GGTTCTCCTCAGGTCCAGTSNP46H54689193657F:GACACCGGCATGGACATTTTR:TCGAGTCGAAGCTCCACAGGSNP55H62016306057.5F:TTGGTCCAATAGTTCGGCGGR:CGGTGTAGTCGGAGACGATGSNP65H65031020256F:CACGCCAAGTGCTTCAGAR:ACCGCAAGGATAGTAGACAGGSNP75H62017496055F:GGCCATCGACATCAGCAAR:CCACCTCCCATTCTTCCAGSNP83H60241762956.5F:CGATGACGATGCCCTTTGR:GCCGTGAACCGCTCTTGTSNP92H76286357352.5F:GAGATTTCAGCAGCCCAGAT