(高清版)GBT 40627-2021 油菜茎基溃疡病菌活性检测方法

油菜茎基溃疡病菌活性检测方法ViabilitytestofLeptosphaeriamaculans(Desm)Ces.etDeNot.2021-10-11发布2022-05-01实施国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。1油菜茎基溃疡病菌活性检测方法本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对油菜茎基溃疡病菌[Leptosphaeriamaculans(Desm.)Ces.etDeNot.]分生孢子进行活性检测的方法。本文件适用于油菜茎基溃疡病菌相关寄主中携带的油菜茎基溃疡病菌分生孢子的活性检测鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。应用荧光染料对油菜茎基溃疡病菌分生孢子进行染色处理，根据碘化丙啶(Propidiumlodide,PI)能够穿透正在死亡或者已经死亡的细胞膜，不能透过具有活力的细胞膜，使不具活性的孢子发出红色荧光、具有活性的孢子不发出荧光的特点，运用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对荧光染料处理的分生孢子进行检测，分析其活性情况。油菜茎基溃疡病菌基本信息见附录A。5仪器和试剂5.1试剂碘化丙啶(PI)溶液配置方法：称取0.01gPI粉末，加入10mL无菌水，配制成浓度为1mg/mL的母液，置于棕色瓶4℃避光保存，使用前配制所需浓度。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):200g去皮土豆切成小方块，加入1000mL自来水，煮沸15min,四层纱布过滤得到滤液，滤液中加入18g葡萄糖、18g琼脂粉，加热溶解后将溶液定容至1000mL,分装到三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。5.2设备激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱、离心机。6活性检测方法6.1检测样品制备在超净工作台中，用解剖针将油菜茎基溃疡病菌分生孢子挑到灭菌水中，充分振荡3min,在显微2镜下检测样品浓度，确定稀释比例，配制成终浓度为10个孢子/μL～100个孢子/μL的孢子悬浮液，镜6.2孢子染色取199μL孢子悬浮液，加入1μL质量浓度为0.1mg/mL的PI染料，混匀，室温下避光染色4min,染色完成后，16000g离心1min去上清液终止染色，加入灭菌去离子水洗涤一次，重新悬浮。避光放置备用。6.3普通荧光显微镜检测吸取5μL活性染料处理之后的样品制备玻片，封片，放置于普通荧光显微镜载物台上，低倍镜下找到孢子，转到100倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰。至少检测30个孢子，观察染色情况。PI染色检测：将荧光光路打开，设置荧光通道的激发波长534nm,收集荧光信号的发射波长617nm,收集荧光信号。微调至视野内图像清晰。染色结果参见附录B。为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况，首先需要确认明场通道下所得到孢子符合油菜茎基溃疡病菌分生孢子形态特征，且图像清晰。6.4激光扫描共聚焦显微镜检测吸取5μL活性染料处理之后的样品制备玻片，封片，置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜下找到孢子，转到100倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰。选择相应的激光管(氩离子激光器)激发荧光信号，PI检测设置荧光通道的激发波长(534nm),收集荧光信号的发射波长(617nm),并设置一个明场通道作为对照。选择低像素扫描模式扫描(xy:512×512),重复扫描次数Average为1次，扫描速度Speed为9,根据成像效果调整探测针孔Pinhole、光电倍增管增益Gain和激光扫描强度ScanStr等参数，将图像调整至质量较好的效果。再用精确扫描方式(xy:2048×2048)根据信噪比调整扫描模式，选择精确像素的平面扫描方式进行粗略扫描(xy:2048×2048),重复扫描次数Average为2次，扫描速度Speed为6,获取最终图像。扫描至少30个孢子，观察染色结果。为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况，首先需要确认明场通道下所得到孢子符合油菜茎基溃疡病菌分生孢子形态特征，且图像清晰。6.5萌发试验取孢子悬浮液100μL,均匀涂布于PDA培养基上，用封口膜封口，置于25℃培养9h以上，观察孢3子萌发情况，以芽管长度大于孢子本身长度视为萌发。7结果判断与表述结果判断与表述如下：——孢子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，所有孢子均无红色荧光，判定油菜茎基溃疡病菌孢子具有活性，参见附录B;——孢子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，所有孢子均呈红色荧光，判定油菜茎基溃疡病菌孢子不具活性，参见附录B;——激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜扫描结果，存在少数分生孢子或个别分生孢子具有很弱的荧光，而无法判断孢子活性的，则对未染色的孢子进行萌发实验，根据萌发情况判定，如萌发则判定具有活性，如不萌发则判定不具有活性。8样品与原始数据保存8.1样品保存存查样品应在4℃条件下妥善保存6个月。如发现具有活性的油菜茎基溃疡病菌孢子的，该样品应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。8.2原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单和检验结果或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。4(资料性)油菜茎基溃疡病菌相关信息A.1基本信息英文名：Crucifersstemcanker,Crucifersblackleg,Phomaleafspot,Cruciferscanker,Crucifersdryrot,Blacklegofcabbage分类地位：真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),格孢腔菌目(Pleosporales),小球腔菌科(Leptosphaeriaceae),小球腔菌属(Leptosphaeria)传播途径：病菌以子囊壳和菌丝体在病残体中越夏和越冬。菌丝体在土中可存活2年～3年，在种子内可存活3年，子囊壳在残株中可存活5年以上。病菌分生孢子可借风雨做短距离传播，病残体和带菌种子是远距离传播的主要方式。A.2寄主范围主要寄主是油菜以及其他十字花科蔬菜，包括芸墓属(Brassica)的一些种，例如油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘蓝(B.oleracea)、花椰菜(B.oleraceavar.botrytis)、结球甘蓝(B.oleraceavar.capitata)、芜菁(B.campestris);野生寄主有葱芥(Alliariapetiolata)、菊科(Asteraceae)、龙胆目(Gentianales)、屈曲花属(Iberis),香雪球(Lobulariamaritima)、紫罗兰属(Matthiola)、柳叶菜科(Onagraceae)、萝卜属(Raphanus)、野芥(Sinapisarvensis)和薪莫(Thlaspiarvense)。A.3症状病菌在寄主花期、收获后和生长期侵染植株叶片、根部、茎部和整个植株。幼嫩的组织更易受到侵染。主要为害症状是叶部损坏、变色，茎部溃疡，严重的整个植株死亡。幼苗的茎、叶上有灰色斑点，成株的茎基部有凹陷的溃疡斑，上有黑色小点。重病株易折断，根部病斑长条形，易腐朽。病菌子囊孢子在适宜条件下沉降于叶片表面，侵入定殖，在叶片组织中扩展，导致茎部系统性的潜在侵染，最终发展为茎溃疡。5(资料性)油菜茎基溃疡病菌孢子染色结果图图B.1～图B.4为PI染料对油菜茎基溃疡病菌孢子的不同染色效果图(普通荧光显微镜)。图B.1PI染料对活孢子在明场下的染色效果图B.3PI染料对死孢子在明场下的染色效果图B.2PI染料对活孢子在荧光通道下的染色效果图B.4PI染料对死孢子在荧光通道下的染色效果6[1]ZhangX,WhiteRP,DemirE,etal.Leptosphaeriaspp.,phomastemcankerandpotentialspreadofL.maculansonoilseedrapecropsinChina[J].PlantPathology,2014,63(3):598-612.[2]BrunH,ChèvreAM,FittBDL,etal.QuantitativeresistanceincreasesthedurabilityofqualitativeresistancetoLeptosphaeriamaculansinBrassicanapus[J].NewPhytologist,2010,185[3]WestJS,KharbandaPD,BarbettiMJ,etal.EpidemiologyandmanagementofLepto-sphaeriamaculans(phomastemcanker)onoilseedrapeinAustralia,CanadaandEurope[J].PlantPa-thology,2001,50(1):10-27.[4]周国梁，尚琳琳，于翠，等.进境油菜籽中黑胫病菌和茎基溃疡病菌的检测[J].植物保护学报，2010(4):289-294.[5]王振华，杨武，赵晖，等.加拿大进境油菜籽茎