(2.11)-4.2chapter4(2)酶工程酶工程酶工程

1第四章酶的提取分离纯化酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的技术过程。主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。2第四章酶的提取分离纯化机械破碎物理破碎化学破碎酶解破碎酸溶液提取碱溶液提取盐溶液提取有机溶剂提取沉淀分离、离心分离膜分离、层析分离电泳分离、萃取分离结晶、干燥浓缩3第五节.过滤与膜分离

过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。根据截留物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透。类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm（1*103-5*105）病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜超滤45.1非膜过滤：采用高分子膜外的物质作为过滤介质,包括粗滤和微滤。第五节.过滤与膜分离

根据过滤介质的不同，可将过滤分为非膜过滤和膜过滤。55.2膜过滤：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。第五节.过滤与膜分离

膜分离压力差膜分离微滤（MF）超滤（UF）反渗透（RO）电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析65.2膜过滤：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。第五节.过滤与膜分离

在酶的分离纯化过程中，通过微滤除去酶液中含有的微生物细胞等。超滤技术不仅用于酶的分离纯化，同时还能达到酶的分离浓缩的目的，特别适用于液体酶制剂的生产。1.对酶的活性无损害，常温常压下即可进行；2.操作简单，能耗低，节约资源，保护环境；类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm（1*103-5*105）病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜7讨论：如果你漂流在大海上，周围的水资源只有海水，如何获得饮用水？8在高浓度水溶液一侧加压，使其与低浓度水溶液侧的压差大于渗透压，则高浓度水溶液中的水将通过半透膜流向低浓度水溶液侧，这一过程称为反渗透。5.2膜分离-反渗透（RO）9细菌、病毒酶、蛋白质aa、糖、二价盐、维生素游离酸、单价盐水微滤反渗透超滤纳滤101、海水淡化2、纯净水生产3、污水处理知识扩展：膜分离的具体应用举例膜分离的具体应用举例——海水淡化112015年7月，三沙市西沙洲，工作人员调试海水淡化设备。2014年1月，三沙市鸭公岛居民用上了海水淡化水12净水器净水器功能可有效滤除水中的铁锈、砂石及直径大于5μm的杂质;可有效去除水中的细菌、毒素。膜分离的具体应用举例——净水器酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的技术过程。主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。13第四章酶的提取分离纯化机械破碎物理破碎化学破碎酶解破碎酸溶液提取碱溶液提取盐溶液提取有机溶剂提取沉淀分离、离心分离膜分离、层析分离电泳分离、萃取分离结晶、干燥浓缩14第六节.层析分离利用混合物中个组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子特性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离的目的。流动相固定相15第六节.层析分离总论16第六节.层析分离总论1.色谱柱的准备2.固定相的制备3.装柱4.平衡5.上样6.洗脱7.收集洗脱液8.洗脱液分析9.柱的再生10.下一轮上样玻璃色谱柱硅胶凝胶颗粒17

层析方法原理吸附层析吸附剂对不同物质吸附力不同分配层析各组分在两相中的分配系数不同离子交换层析离子交换剂上的活性基团对各离子的亲和力不同凝胶层析各组分相对分子量不同亲和层析分子与配基间专一又可逆的亲和力层析聚焦将两性物质的等电点特性与离子交换层析相结合第六节.层析分离总论6.1吸附层析18吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析是各种层析中最早应用的技术。196.1.1吸附层析的原理活性炭吸附剂一般是多孔的固体，固体内部分子力是对称的，而固体表面的分子受力不对称，向内一面受到固体内部分子的作用力，就会被吸附到固体表面上。吸附剂选择：通常用于酶的分离纯化的吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。206.1.2吸附剂与洗脱剂的选择硅藻土硅胶活性炭洗脱剂选择原则：1、不会与吸附剂作用，不会使吸附剂溶解2、对混合液各组分溶解度大，粘度小，流动性好，容易与

被洗脱组分分离3、有一定纯度，以免杂质对分离带来不利影响216.1.2吸附剂与洗脱剂的选择常用的洗脱剂有石油醚、四氯化碳甲苯、乙醚、氯仿、丙酮、乙醇等有机溶剂。6.1.3吸附层析的操作22吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。236.2分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。固定相、流动相、展开剂、溶剂.Eg：纸层析。纸层析246.2分配层析薄层层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。固定相、流动相、展开剂、溶剂.Eg:薄层层析（TLC）底物产物256.3离子交换层析结合洗脱离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。26母体6.3.1阳离子交换剂与阴离子交换剂常用的母体有纤维素、树脂、凝胶。常用的活化基团有酸性基团如磺酸基、磷酸基;

碱性基团如季铵、DEAE等。活化基团27按活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。6.3.1阳离子交换剂与阴离子交换剂+++离子交换剂和它们所吸引的电荷---阳离子交换剂阴离子交换剂若活性基团带负电荷，则能吸引带正电荷的例子，称为阳离子交换剂。若活性基团带正电荷，则能吸引带负电荷的离子，称为阴离子交换剂。28母体常用的阳离子交换剂有羧甲基CM-纤维素,磷酸基PO3-,磺酸基SO3-常用阴离子交换剂：DEAE-Sephadex（二乙胺基乙基-葡聚糖凝胶）6.3.1阳离子交换剂与阴离子交换剂活化基团29由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。调节溶液pH环境就可以实现。思考：纯化酶分子用哪种离子交换剂呢？6.3.1阳离子交换剂与阴离子交换剂306.3.2离子交换层析流程离子交换层析操作流程装柱：干法装柱、湿法装柱平衡：缓冲液上柱：流速洗脱：洗脱液、梯度洗脱再生：缓冲液（酸碱溶液）316.3.2离子交换层析流程装柱平衡上柱洗脱再生缓冲液离子待分离样品1待分离样品2326.3离子交换层析装柱平衡上柱洗脱再生洗脱液1洗脱液233装柱平衡上柱洗脱再生6.3.2离子交换层析流程缓冲液离子洗脱液1洗脱液2346.3.3离子交换层析结果分析阴离子交换层析原理示意图上柱吸附洗脱35凝胶层析又称分子筛层析，凝胶过滤或分子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中个组分的相对分子质量不同而进行分离的技术。常用凝胶：葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖(Sepharose)

、聚丙烯酰胺（PAGE）。6.4凝胶层析多孔凝胶电镜图示36凝胶层析最先洗脱下来的是小分子还是大分子？6.4.1凝胶层析分离原理1、在凝胶层析的洗脱过程中，（）A、分子质量最大的分子最先流出B、分子质量最小的分子最先流出C、蛋白质分子最先流出D、盐分子最先流出376.4.1凝胶层析分离原理c当混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。386.5亲和层析利用生物分子与配体之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。常用琼脂糖凝胶作为母体。39载体配体臂待分离组分亲和吸附洗脱再生杂蛋白目的酶6.5.1亲和层析流程图配基固相化洗脱剂406.5.1亲和层析流程图41思考：如果我们要分离一种酶分子，那么可以利用什么作为配体？42分离产物相应的配基酶抗体凝集素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白6.5.2亲和层析的应用亲和层析分离可保持蛋白活性，分离特异性高，在酶的分离纯化中有重要应用。43

层析方法原理吸附层析吸附剂对不同物质吸附力不同分配层析各组分在两相中的分配系数不同离子交换层析离子交换剂上的活性基团对各离子的亲和力不同凝胶层析各组分相对分子量不同亲和层析分子与配基间专一又可逆的亲和力第六节.层析分离小结44第六节.层析分离小结根据样品混合液的成分，如果杂质较多，先用

；若样品溶解度差别很大，可以用

；若样品混合液中成分都带有电荷或目的酶与杂蛋白等电点显著不同的可以用

；若分子量大小显著不同可以用

，若目的蛋白与某特殊物质的专一性很强可用

。

吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的技术过程。主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。45第四章酶的提取分离纯化机械破碎物理破碎化学破碎酶解破碎酸溶液提取碱溶液提取盐溶液提取有机溶剂提取沉淀分离、离心分离膜分离、层析分离电泳分离、萃取分离结晶、干燥浓缩46第七节电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。不同物质由于其带电性质不同及其颗粒大小不同，在电场中的移动方向和速度也不同，从而实现分离。纸电泳薄层电泳凝胶电泳等电点聚焦电泳颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。47第七节

电泳分离电泳分离的时候，移动速度最快是大分子还是小分子？电泳中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。混合样品带孔凝胶

小分子大分子7.1凝胶电泳原理凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术，常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。49等电聚焦电泳(