甾体激素类药物的分析

甾体激素类药物的分析激素（Hormone，荷尔蒙）是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用。如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。甾体激素类药物的分析ABCD12345678910111213141516171819

基本结构

概述甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢菲母核。甾体激素类药物的分析

分类甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素孕激素雌激素蛋白同化激素甾体激素类药物的分析

（一）肾上腺皮质激素△4–3–酮基（紫外吸收）天然皮质激素：氢化可的松

母核有21个碳原子C17–醇酮基（还原性）甾体激素类药物的分析醋酸地塞米松结构修饰曲安息龙地塞米松磷酸钠提高结构稳定性增强抗炎作用甾体激素类药物的分析（二）雄性激素和蛋白同化激素

天然雄性激素：睾酮

△4–3–酮基4位引入卤素或19位去甲基或将A环结构改造均明显降低雄性作用，增加蛋白同化作用

母核有19个碳原子

A环中有△4–3–酮基结构甾体激素类药物的分析结构修饰增加脂溶性，制成油注射剂可口服、延效丙酸睾酮甲睾酮增加位阻，难代谢氧化，稳定性增强可口服甾体激素类药物的分析蛋白同化激素苯丙酸诺龙4-氯醋酸睾丸素

母核有18或19个碳原子甾体激素类药物的分析（三）孕激素C17-

-甲酮基△4–3–酮基天然孕激素：黄体酮

母核有21个碳原子

口服被迅速破坏失效，只能肌注甾体激素类药物的分析结构修饰醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）炔诺孕酮（睾酮类孕激素）炔诺酮（睾酮类孕激素）口服、长效口服、长效，17-OH作成庚酸酯，注射一次可维持3个月甾体激素类药物的分析（四）雌激素

天然的雌性激素：雌二醇

母核有18个碳原子

A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有β-羟基

结构不稳定，口服无效甾体激素类药物的分析结构修饰

炔雌醇

戊酸雌二醇

苯甲酸雌二醇乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻碍酶对药物的氧化代谢，可口服17位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效3位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效可口服高效长效甾体激素类药物的分析人工合成代用品：非甾体化合物己烯雌二酚高效、长效甾体激素类药物的分析△4–3–酮C17–α–醇酮基C17–β–羟基C17–甲酮基A环为3–OH苯环肾上腺皮质激素++雄性与蛋白同化激素++雌性激素++孕激素++鉴别反应UV、羰基试剂、氨基脲反应还原性（碱性酒石酸酮、氨制AgNO3）可成酯与亚硝基铁氰化钠、间二硝基苯反应UV、与重氮苯磺酸盐反应二、特殊官能团与分析方法甾体激素类药物的分析第二节鉴别试验一、物理常数的测定二、化学鉴别法三、制备衍生物测定熔点四、紫外分光光度法五、红外分光光度六、薄层色谱法七、高效液相色谱法甾体激素类药物的分析第二节鉴别试验二、化学鉴别法（一）呈色反应（1）与强酸的呈色反应强酸：

H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与HSO4-作用呈色。甾体激素类药物的分析显色荧光加水稀释氢化可的松棕黄色至红色绿色黄色至橙黄色炔雌醇橙红黄绿玫红絮状↓炔雌醚橙红黄绿红色↓泼尼松黄→橙—黄色渐变蓝绿色泼尼松龙深红—灰色絮状↓地塞米松淡红棕色—颜色消失苯甲酸雌二醇黄绿色蓝色淡橙色与硫酸显色反应甾体激素类药物的分析1、C3–酮基和C20–酮基（1）与羰基试剂2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼反应生成腙。(2)官能团的呈色反应（2）与羟胺或氨基脲分别生成具有一定熔点的肟或缩氨脲。甾体激素类药物的分析+HCl黄色3，20-双腙室温下长时间加热甾体激素类药物的分析结论：成腙反应中

C20–酮基受C18甲基的空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。

C11–酮基受C18、C19位甲基甲基的阻碍，不发生反应。

C3–酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下先生成单腙。甾体激素类药物的分析2、C17–α–醇酮基的呈色反应（还原性）

能与碱性酒石酸铜试液（斐林试液）、氨制AgNO3试液（多伦试液）、四氮唑盐反应呈色。其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色剂，还可用于含量测定.

适用：肾上腺皮质激素。甾体激素类药物的分析＋2Cu2++4OH-+Cu2O+H2O橙红色＋2Ag++2OH-+2Ag+CH3COOH黑色醋酸去氧皮质酮甾体激素类药物的分析+H2O+CH3COOH++OH-醋酸泼尼松深红色的三苯甲鐕四氮唑盐甾体激素类药物的分析结论：

三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比色法测含量。

四氮唑盐反应还用于肾上腺皮质激素类药物中杂质“有关物质”检查的显色剂。

反应在碱性条件下（水解）进行。甾体激素类药物的分析

适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物。3.甲酮基的呈色反应

能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色。孕激素（1）甲酮基：黄体酮专属性反应。黄体酮其他甾体亚硝基铁氰化钠蓝紫色淡橙色或不显色甾体激素类药物的分析结论：

在碱性条件下进行。

与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应。（2）亚甲基的反应：硫酸普拉睾酮

乙醇间二硝基苯氢氧化钠紫红色甾体激素类药物的分析

适用：雌激素类药物。4.酚羟基的呈色反应

能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。苯甲酸雌二醇H++红色甾体激素类药物的分析有机氟Fˉ有机破坏有机氯5、卤元素的呈色反应茜素氟蓝—硝酸亚铈硝酸—硝酸银呈蓝紫色

ClˉAgCl氯原子结合在母核环上甾体激素类药物的分析6、沉淀反应（1）与碱性酒石酸铜（斐林试液）的沉淀反应（2）氨制AgNO3（多伦试液）的沉淀反应（3）与AgNO3的沉淀反应

适用：含炔基的甾体激素类药物（炔雌醇、炔诺酮）。

机理：↓HNO3++NaOH滴定，电位法指示终点甾体激素类药物的分析（4）与HNO3-AgNO3的沉淀反应

适用：甾体激素类药物C21位上有氯原子取代，如丙酸氯倍他索。

机理：有机氯原子水解加热无机氯原子结合在母核环上的氯原子氧瓶燃烧法破坏无机氯原子硝酸—硝酸银AgCl甾体激素类药物的分析

原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。7、水解产物的反应

适用：本类药物C3、C17或C21位上羟基的酯

结果：醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。

戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。甾体激素类药物的分析三、制备衍生物测熔点（二）酯的水解醇制KOH

水解m.p.为150℃~156℃（一）酯的生成+KOH丙酸睾丸素睾丸素m.p.为201℃+甾体激素类药物的分析m.p.约182℃（分解）（三）缩氨基脲的生成苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨脲H2NCONHNH2（四）酮肟的生成炔诺酮HONH2炔诺酮肟m.p.约195℃（分解）醋酸泼尼松甾体激素类药物的分析△４-3-酮（五）UV-ViS分光光度法240nm左右280nm左右苯环其他共轭结构原理200-760nm有特征吸收。方法可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小。甾体激素类药物的分析

示例曲安息龙丙酸倍氯米松溶剂甲醇乙醇浓度20μg/ml20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为0.57～0.60，在239nm与263nm处的吸收度比值为2.25～2.45甾体激素类药物的分析结构特征：酚羟基

C17–OHC17–乙炔基eg1:炔雌醇（六）IR法原料药甾体激素类药物的分析1505cm-13505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动甾体激素类药物的分析eg2：黄体酮△４-3-酮结构特征：C17-酮基甾体激素类药物的分析1700cm-1

C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1

C-H双键甾体激素类药物的分析七、TLC法八、HPLC应用甾体激素类药物原料与制剂的鉴别甾体激素类药物原料与制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）方法对照品法对照品法结果判断要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致甾体激素类药物的分析第三节特殊杂质检查

杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。一、有关物质的检查

其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。甾体激素类药物的分析检查方法：（具有一定分离能力）判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色1、TLC法（自身对照法）eg：氢化可的松中其他甾体的检查供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1）浓度：3.0mg/ml

对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1）60μg/ml

层析：供试液对照液点样、展开、斑点检出。判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。甾体激素类药物的分析2、HPLC法（自身对照法）≤图A中峰1面积的四分之三判定方法：规定杂质峰数目规定杂质峰面积甾体激素类药物的分析二、游离磷酸盐的检查

方法：对照品比色法

杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐。

结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。740nm

原理：供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸钼蓝甾体激素类药物的分析三、有机溶剂残留量的检查eg：地塞米松磷酸钠

方法：GC色谱法

杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。

结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量≤0.3％丙酮规定不得过≤5.0%甾体激素类药物的分析四、硒的检查氧瓶燃烧二氨基萘比色法测定

杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，药物可能引入杂质硒。

方法：药物

结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度（0.005％～0.01％）

。378nm五、雌酮六、乙炔基甾体激素类药物的分析第四节含量测定

常用方法容量法比色法紫外分光光度法荧光法气相色谱法高效液相色谱四氮唑盐比色法异烟肼比色法铁-酚试剂比色法甾体激素类药物的分析一、HPLC法USP、BP、JP均采用方法：RP－HPLC（内标法）

测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。eg：黄体酮的含量测定

色谱条件：固定相ODS，检测波长254nm

流动相甲醇-水（65:35）内标物己烯雌酚系统适用性试验：n>1000，R符合规定。

甾体激素类药物的分析测定样品：黄体酮原料、注射液。

定量方法：内标法内标-1甾体激素类药物的分析二、UV-ViS分光光度法1、△４-3-酮240nm（±）2、苯环280nm（±）雌激素肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素（一）UV分光光度法缺点：专属性不强甾体激素类药物的分析示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查（1）配制供试液，取10片分别进行测定

（2）测定：240nm

（3）计算

甾体激素类药物的分析（二）比色法有色甲瓒四氮唑盐醇酮基-a-17COH-1、四氮唑盐比色法（1）原理：肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基强还原性。[H]氯化三苯四氮唑（TTC）三苯甲瓒↓深红甾体激素类药物的分析蓝四氮唑（BT）525nm甾体激素类药物的分析25℃氢氧化四甲基铵对照液供试液ATTC40～45′暗（2）方法：对照品法（3）影响因素A.基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH未酯化＞C21-OH酯化甾体激素类药物的分析B、溶剂和水分的影响

以无水乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5％对结果没有影响。C、O2与光线的影响避光、隔绝空气、快速、充N2D、碱的种类及加入顺序以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：皮质激素溶液四氮唑盐碱试液甾体激素类药物的分析E.温度与时间室温（25℃）反应40～45minF.干扰物的影响

油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT的显色反应有干扰，要先分离后测定。甾体激素类药物的分析（1）原理异烟腙（黄）HCl420nm2、异烟肼比色法C3-酮基+异烟肼H2O肾上腺皮质激素雄性激素蛋白同化激素孕激素甾体激素类药物的分析（2）方法：对照品法60℃异烟肼无水甲醇对照液供试液A暗60′甾体激素类药物的分析（3）影响因素A.反应速度（反应专属性）C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应B.溶剂的选择异烟肼盐酸盐→受溶解度的影响无水甲醇无水乙醇对试剂的稳定性好呈色强度较无水乙醇中高对植物油的溶解度小甾体激素类药物的分析C.水分、温度、O2与光线的影响

含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓O2与光线对反应的影响不大t℃↑→ν↑D.酸的种类和浓度及异烟肼的浓度

酸:异烟肼=2: