VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座

WhatareRNAi?RNAi现象早在1993年就有报道:将产生紫色素基因转入开紫花矮牵牛中,希望得到紫色更深花,可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。当初认为这是矮牵牛原来有紫色素基因和转入外来紫色素基因都失去了功效,称这种现象是“共抑制”。直到1998年,Fire等研究证实,在正义RNA阻断了基因表示试验中,真正起作用是双链RNA,使基因“缄默”了。研究人员将这一现象称为RNA干扰(RNA

interference,RNAi)。研究者所以取得了年诺贝尔生理学或医学奖。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第1页WhatareRNAi?RNA干扰广泛存在于生物界，在不一样物种中RNA干扰被赋予不一样名称:在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression）在真菌中被称为基因阻抑（qulling）在动物体内被称为RNA干扰（RNAi）现今用于植物RNAi技术按导入方式不一样有粒子轰击、病毒诱导基因缄默(VIGS)、农杆菌介导等方式。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第2页VirusInducedGeneSilencing(VIGS)病毒诱导基因缄默(virusinducedgenesilencing,VIGS)是指经过对已知植物病毒改造，将目标基因片段整合入病毒载体中，然后侵染植物,诱发RNAi路径,伴随病毒复制和转录而特异性地诱导序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引发植物表型或生理指标改变，实现对该功效基因判定。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第3页VIGS原理

dsRNA:双链RNA;Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ(RibonucleaseⅢ,RNaseⅢ)家族组员;

siRNA:小干扰RNA;

RISC:RNA诱导缄默复合体VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第4页VIGS应用载体利用植物病毒作为载体优点:病毒能吸附到完整植物细胞并将它们核酸导入到细胞中感染植物细胞产生大量病毒，所以重组病毒载体能够高效表示转入外源基因。病毒感染能够蔓延整个植株病毒感染快VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第5页VIGS应用载体RNA病毒(最早最多)→1995,首次基于烟草花叶病毒TMV载体构建(携带八氢番茄红素脱氢酶PDS侵染烟草，上位叶片褪绿白化)→1998,马铃薯X病毒PVX(缄默PDS诱发白化效应)→,烟草脆裂病毒TRV(因其含有病毒症状较轻、缄默效率高、连续时间长、能够侵染分生组织应用，当前应用最广泛VIGS载体)PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需酶，具保护叶绿素免受光漂白作用，而PDS基因发生缄默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。PDS表型变异易于区分，所以PDS基因成为VIGS体系评价参考基因。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第6页VIGS应用载体DNA病毒(载体构建简便、无需体外转录、操作难度低)→1998,基于双生病毒番茄金色花叶病毒TGMVVIGS体系成功建立(第一例DNA病毒载体)→,非洲木薯花叶病毒ACMV→,棉花皱叶病毒CLCrV→,水稻东格鲁杆状病毒RTBV(实现农杆菌介导接种高效缄默水稻內源基因PDS，第1例能够经过农杆菌介导接种水稻VIGS载体)VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第7页VIGS应用寄主寄主范围有限，针对不一样寄主植物往往需要开发不一样病毒载体。，大麦抑制PDS（大麦条纹花叶病毒BSMV，深入在小麦上应用）→，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒BMV→，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒BPMV）→，大豆（改造后无需体外转录，增加缄默效率）VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第8页VIGS应用抗旱研究中相关基因功效分析，缄默小麦上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(γ-ECS)三个基因。缄默植株经干旱胁迫后较正常植株在形态上有显著改变，其叶片卷曲萎蔫程度较为突出，说明这三个基因在小麦抗干旱胁迫中含有主要功效。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第9页VIGS应用品质改良相关基因功效分析，利用VIGS技术发觉高分子量谷蛋白亚基HMV-GS

1Bx14和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成相关。这也是首次报道VIGS技术应用于小麦穗子和籽粒相关基因功效，同时这个体系建立将会对研究与籽粒品质和在小麦渐成籽粒中相关基因功效起到很大帮助作用。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第10页VIGS优点在未获取全长序列甚至事先不知道序列情况下即可进行VIGS分析。操作简便，能快速获取表型。无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难植物种类来说至关主要可用于突变致死基因功效研究。可用于功效冗余基因功效研究。可用于快速不一样植物种类间比较基因组学研究。VIG病毒诱导基因沉默技术专家讲座第11页VIGS缺点

VIGS引发目标基因缄默特征不含有遗传性，以致VIGS技术并不能彻底揭示基因功效，这是此种技术本身