生物化学蛋白质化学下专家讲座

四超二级结构和结构域

超二级结构（supersecondarystructure）是指在多肽链中彼此邻近二级结构在空间折叠时相互靠近，相互作用，形成了一个有规则二级结构聚集体，称为超二级结构。当前发觉超二级结构有α螺旋组合（αα）、β折叠组合（βββ）和α螺旋β折叠组合（βαβ），其中以βαβ组合最为常见。这些超二级结构能够直接作为组成单位参加三级结构或结构域构建，它是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间一个过渡层次，故称超二级结构。也称为基元(motif)或基序或模体。

蛋白质超二级结构是指由若干相邻二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则在空间上能够识别二级结构组合体，有三种基本组合形式αα、αβα、βββ。生物化学蛋白质化学下专家讲座第1页生物化学蛋白质化学下专家讲座第2页

结构域（StructuralDomain）是介于二级和三级结构之间一个结构层次。是指蛋白质亚基结构中显著分开紧密球状结构区域，是蛋白质三级结构内独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元组合。结构域与结构域之间经常有一段长短不等肽链相连，形成所谓铰链区。不一样蛋白质分子中结构域数目不一样，同一蛋白质分子中几个结构域彼此相同或很不相同。常见结构域氨基酸残基数在100～400个之间，最小结构域只有40～50个氨基酸残基，大结构域可超出400个氨基酸残基。结构域普通都含有一定功效。也叫模体（motif）或基序生物化学蛋白质化学下专家讲座第3页生物化学蛋白质化学下专家讲座第4页生物化学蛋白质化学下专家讲座第5页

-螺旋

-转角HTH模体结构示意图螺旋-转角-螺旋模体由2个

螺旋和1个

转角组成。HTH模体是DNA结合蛋白三维结构中一部分，每一DNA结合蛋白含一个HTH模体，位于分子表面。DNA结合蛋白常以二聚体形式存在，两个HTG模体相距3.4nm，与DNA螺距相当，分别结合于DNA分子中相邻两个深沟中。HTH模体约由20个氨基酸残基组成，第1个

螺旋含7个氨基酸残基，

转角含4个氨基酸残基，第2个

螺旋含9个氨基酸残基。第2个

螺旋是DNA识别部位，结合于DNA分子深沟中。

螺旋

螺旋

转角NC模体：在许多蛋白质分子中，常发觉几个（多为2

3个）含有二级结构肽段相互靠近，形成含有特定功效空间构象；或者仅是一个含有特定功效很短肽段。

模体（motif）生物化学蛋白质化学下专家讲座第6页五球状蛋白三级结构

由蛋白质二级结构、超二级结构或结构域相互连接组合形成蛋白质构象结构称谓蛋白质三级结构。含有三级结构多肽链称谓亚基（subunit）。单个多肽链组成蛋白，含有三级结构才能有活性。多条肽链形成蛋白，需要亚基深入组合才能有活性。亲水基团在外，疏水基团在内，形成疏水关键。生物化学蛋白质化学下专家讲座第7页生物化学蛋白质化学下专家讲座第8页维持蛋白质三级结构化学键为非共价键氢键；盐碱（离子键）；疏水键；范德华力；配位键；二硫键生物化学蛋白质化学下专家讲座第9页六蛋白质四级结构由两条或以上含有三级结构多肽链以非共价键形式组合在一起，形成结构称谓蛋白质四级结构。生物化学蛋白质化学下专家讲座第10页

1

2

2

1NCNC血红蛋白四级结构成人血红蛋白由2条

链和2条

链组成,各亚基分别含一个血红素.生物化学蛋白质化学下专家讲座第11页生物化学蛋白质化学下专家讲座第12页第四节蛋白质结构与功效关系自然规律：结构决定功效，功效反应结构一蛋白质一级结构决定高级结构二结构与功效一级结构相同蛋白序列相同；氨基酸变异造成功效丧失。空间结构与功效构象与功效镰刀型贫血症：生物化学蛋白质化学下专家讲座第13页生物化学蛋白质化学下专家讲座第14页

表中九种动物之间胰岛素分子一级结构中存在氨基酸残基组成差异不影响胰岛素生物活性。临床上曾经应用猪和牛胰岛素治疗人糖尿病，取得了显著疗效。

胰岛素分子中氨基酸残基差异部分来源氨基酸残基差异部分A8A9A10B30人ThrSerIleThr猪TheSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrSerIleSer牛AlaSerValAla羊AlaGlyValAla马ThrGlyIleAla抹香鲸ThrSerIleAla

鲸AlaSerThrAla生物化学蛋白质化学下专家讲座第15页

丝氨酸蛋白酶催化基团丝氨酸周围固定氨基酸序列

丝氨酸蛋白酶是活性中心含有丝(或苏)氨酸蛋白水解酶家族。从表中可见，其活性部位丝氨酸（195）附近氨基酸残基序列相似。表中蓝色标识氨基酸为同源序列。丝氨酸蛋白酶含有相同一级结构和相同三级结构。生物化学蛋白质化学下专家讲座第16页

动物体细胞色素C一级结构进化树图中数字表示该类动物与其祖先相比细胞色素C一级结构氨基酸残基差异数生物化学蛋白质化学下专家讲座第17页0

10

121101110101093201110653010954230

98654520

1011786766013121110910981201312121110109810201110109887610330

14152221202119182119201701514111099891188722018171413111211111311121124100212119181718171718171817261815027262222222122212423242229242224031302928272527262828272731282932140人,猩猩猕猴马驴猪、牛、羊狗小灰鲸兔袋鼠鸡、火鸡企鹅北京鸭响尾蛇啮龟牛蛙金枪鱼螺旋蝇蚕蛾

蚕蛾螺旋蝇金枪鱼牛蛙啮龟响尾蛇北京鸭企鹅鸡，火鸡袋鼠兔小灰鲸狗猪牛羊驴马猕猴人，猩猩人与一些动物细胞色素C一级结构氨基酸差异数量比较生物化学蛋白质化学下专家讲座第18页

磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶结构域1空间构象相同性

磷酸丙糖异构酶催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮互变，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转移磷酸基生成ATP和烯醇式丙酮酸，但其空间结构含有相同性，其空间结构中心均是由

8个

-折叠组成-折叠桶，每个

-折叠又被

-螺旋所分隔磷酸丙糖异构酶丙酮酸激酶结构域1生物化学蛋白质化学下专家讲座第19页生物化学蛋白质化学下专家讲座第20页朊病毒与蛋白质构象病

朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等各种细胞细胞膜上糖蛋白。朊病毒（prion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（PrPc）空间构象由

螺旋变成

折叠所致。朊病毒本身不能自我复制，但能够攻击大脑正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此二聚表达再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。周而复始，脑组织中朊病毒不停积蓄，造成脑组织发生退行性病变。生物化学蛋白质化学下专家讲座第21页

正常朊病毒蛋白与朊病毒空间结构差异朊病毒（PrPsc）是蛋白质，不含核酸。它是正常朊病毒蛋白（PrPc）空间构象由

-螺旋变成

-片层结构所致。所以，这类疾病又称蛋白质构象病。朊病毒本身不能复制，但它却能够攻击大脑正常朊病毒蛋白，使其发生构象改变，并与其结合，成为致病朊病毒二聚体。此二聚体再攻击正常朊病毒蛋白。这样，脑组织中朊病毒不停积蓄，造成脑组织发生退行性变。

正常朊病毒蛋白结构（显示

-螺旋）

朊病毒结构（显示

-片层结构）生物化学蛋白质化学下专家讲座第22页详细几个蛋白功效胰岛素（Insulin）血红蛋白（Hemoglobin）免疫球蛋白（Immunoglobulin）膜蛋白结构前蛋白原活化生物化学蛋白质化学下专家讲座第23页

人胰岛素一级结构胰岛素由A、B两条多肽链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基。A链内有一个链内二硫键，A与B之间有两个链间二硫键。因为两条链之间由共价键相连接，所以胰岛素没有四级结构。SerGlyIleValGluGlnCysCysThrIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGlyGluArgPhePheTyrThrProLysThrNH215101520COOHA链NH2151015202530HOOCB链生物化学蛋白质化学下专家讲座第24页生物化学蛋白质化学下专家讲座第25页生物化学蛋白质化学下专家讲座第26页生物化学蛋白质化学下专家讲座第27页胞外区跨膜区胞内区生物化学蛋白质化学下专家讲座第28页生物化学蛋白质化学下专家讲座第29页第五节蛋白质性质一蛋白质胶体性质亲水胶体(1-100nm)粒子，含有胶体溶液性质（真溶液）丁达尔现象；布朗运动；不透过半透膜；稳定胶体溶液（真溶液）。生物化学蛋白质化学下专家讲座第30页透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋经过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中小分子物质经过透析被分离除去。生物化学蛋白质化学下专家讲座第31页形成稳定胶体溶液原因：水化膜和同性电荷蛋白质所带电荷和其周围包绕水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳定两大原因。脱水和中和电荷能够造成蛋白质沉淀。水化膜正电荷++++++++++++++++++++++++

H+OH-OH-OH-H+H+脱水脱水脱水蛋白质在等电点时亲水胶体带负电荷亲水胶体蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质带正电荷亲水胶体带正电荷疏水胶体不带电疏水胶体（极易沉淀）带负电疏水胶体负电荷生物化学蛋白质化学下专家讲座第32页二两性解离和等电点pIpHpH﹤﹤生物化学蛋白质化学下专家讲座第33页

三蛋白质变性作用和复性

生物化学蛋白质化学下专家讲座第34页

牛胰核糖核酸酶分子变性与复性变性是指蛋白质在一些理化原因作用下，其正常空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，造成蛋白质理化性质改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性丧失。蛋白质变性不影响其一级结构。三蛋白质变性作用和复性生物化学蛋白质化学下专家讲座第35页变性物理原因：加热、紫外线照射、超声、猛烈震荡等化学原因：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等沉淀改变pH至pI破坏水溶液中蛋白质水化膜和中和电荷（变性蛋白质）（蛋白质未变性）凝固加热（变性，不再溶解）变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固均变性并不溶解加热生物化学蛋白质化学下专家讲座第36页蛋白质变性（Denaturation）蛋白质复性（Renaturation)四蛋白质沉淀（sedimentation）作用precipitation（沉淀）；Aggregation（凝集）1中性盐法盐析（salting-out）；分段盐析（gradingsalting-out）重金属盐2有机溶剂乙醇；丙酮3生物碱单宁酸；苦味酸4有机酸三氯乙酸生物化学蛋白质化学下专家讲座第37页第六节蛋白质分离纯化与测定一普通标准步骤材料取得与破碎（机械、渗透、冻融、超声和酶解等）蛋白抽提蛋白粗体（沉淀）蛋白质分离（精纯化）测定：浓度；纯度；分子量；性质功效判定等生物化学蛋白质化学下专家讲座第38页

蛋白质理化性质与惯用纯化方法二蛋白质提取与纯化原理生物化学蛋白质化学下专家讲座第39页（一）改变蛋白质溶解度盐析：

高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出有机溶剂沉淀：

降低溶液介电常数，使蛋白质分子间相互吸引而沉淀生物化学蛋白质化学下专家讲座第40页（二）依据蛋白质分子大小不一样分离方法离心(centrifugation)：

利用机械快速旋转所产生离心力，将不一样密度物质进行分离

依据转速分类：惯用离心机<10000rpm

高速离心机20000~25000rpm

超速离心机>50000rpm

相对离心力（×g）=1.119×10–5×（rpm）2×r

依据应用分类：分析型离心机制备型离心机[g:gravity,rpm:revolutionperminut,r:离心半径]生物化学蛋白质化学下专家讲座第41页匀浆沉淀上清1000g,5min上清上清上清上清沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀4000g,10min15000g,20min30000g,30min100000g,90min100000g,180min（未破坏真核细胞）（细胞膜碎片，细胞核）（线粒体，细菌）（溶酶体，菌体碎片）（微粒体）（核糖核蛋白体）胞液

亚细胞成份差速离心分离差速离心法是沉降速度离心一个，采取离心力由小到大分阶段离心方法，将密度不一样物质分步骤地逐一分离开来。亚细胞结构分离就是其中最好例子。差速离心法生物化学蛋白质化学下专家讲座第42页

几个蛋白质分子量与沉降系数关系在单位力场下，溶质分子沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其百分比常数为沉降系数，用S表示，单位为秒。=s·

2

普通蛋白质沉降系数为10

13

10

12秒，故人们以Svedberg(S)单位来表示沉降系数，即1S=10

13秒。沉降系数大小与蛋白质密度和形状相关。生物化学蛋白质化学下专家讲座第43页透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋经过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中小分子物质经过透析被分离除去。生物化学蛋白质化学下专家讲座第44页超滤（ultrafiltration）:

在一定压力下，使蛋白质溶液在经过一定孔径超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量蛋白质被截留，从而到达分离纯化目标。这种方法既能够纯化蛋白质，又可到达浓缩蛋白质溶液目标。

磁力搅拌器待超滤蛋白质溶液加压氮气超滤膜生物化学蛋白质化学下专家讲座第45页凝胶过滤（gelfiltration）：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质经过胶粒微孔进入胶粒，向下流动路径加长，移动迟缓；大分子物质不能或极难进入胶粒内部，经过胶粒间空隙向下流动，其流动路径短，移动速度较快，从而到达按不一样分子量将溶液中各组分分开目标

生物化学蛋白质化学下专家讲座第46页洗脱液胶粒样品小分子大分子蛋白浓度洗脱体积各试管进行连续搜集试管走行方向

凝胶过滤分离蛋白质示意图凝胶过滤生物化学蛋白质化学下专家讲座第47页

凝胶过滤分离蛋白质示意图生物化学蛋白质化学下专家讲座第48页依据各种蛋白质在一定pH环境下所带电荷种类与数量不一样特点，将不一样蛋白质给予分离。惯用方法有：离子交换层析电泳等电聚焦。

（三）依据蛋白质电荷性质分离方法生物化学蛋白质化学下专家讲座第49页低盐浓度洗脱液高盐浓度洗脱液各试管进行连续搜集混合蛋白质离子交换层析柱++++++++++++++++

离子交换层析分离蛋白质示意图试管走行方向离子交换层析(ionexchangechromatography)：生物化学蛋白质化学下专家讲座第50页生物化学蛋白质化学下专家讲座