抗体专业知识讲座

抗体专业知识讲座抗体专业知识讲座第1页抗体与免役球蛋白在概念上区分一、名词性质

抗体-免疫学,针对某种抗原免役球蛋白-化学二、分类抗体-很多,复杂免役球蛋白-按化学性质分为

IgG.IgM,IgA,IgD,IgE

抗体专业知识讲座第2页三、抗原有没有抗体-不存在没有抗原抗体免役球蛋白-不一定有抗原

四、提取方法抗体-亲和层析免役球蛋白-用化学方法

五、纯度抗体-免役纯免役球蛋白-化学纯抗体专业知识讲座第3页六、定量方法抗体-免疫学(效价)

免役球蛋白-化学方法(蛋白质浓度)七、特异性部位抗体-Fab（可变区）免疫球蛋白—Fc八、多样性抗体—大免疫球蛋白—小抗体专业知识讲座第4页抗体与免疫球蛋白在概念上区分项目抗体（antibody）免疫球蛋白（immunoglobulin）名词性质免疫学，针对某种抗原化学分类很多、复杂按化学性质IgG.IgM,IgA,IgD,IgE抗原有没有不存在没有抗原抗体不一定有抗原性提取方法亲和层析用化学方法纯度免疫纯化学纯定量方法免疫学（效价）化学方法（蛋白质浓度）特异性部位FabFc多样性高低抗体专业知识讲座第5页一、抗体分子结构单体分子结构水解片段与生物学活性免疫球蛋白特殊分子结构抗体专业知识讲座第6页抗体（免疫球蛋白）分子基础结构是怎样确定？1950s－1960sRodneyPorterGeraldEdelmanAlfredNisonoff抗体专业知识讲座第7页酶水解和还原PorterandEdelman用papain水解IgGNissonoff用Pepsin水解IgG抗体与降解片段反应抗Fab片段抗体（可与轻链和重链结合）抗Fc片段抗体（只与重链结合）抗体专业知识讲座第8页抗体专业知识讲座第9页PapainFcFabPepsinFcPeptidesF(ab’)2抗体专业知识讲座第10页免疫球蛋白氨基酸序列确实定多发性骨髓瘤（multiplemycloma）骨髓瘤蛋白（myclomaprotein）多发性骨髓瘤病人血清中免疫球蛋白有95％是骨髓瘤蛋白；骨髓瘤细胞能够分泌大量轻链，在骨髓瘤病人尿中能够发觉，称为Bence－Jonesprotein，动物也有多发性骨髓瘤，如小鼠骨髓瘤细胞。抗体专业知识讲座第11页轻链序列确定：Bence－Jonesprotein重链序列确定：用mercaptoethanol还原和alkylation骨髓瘤蛋白，再经层析分离取得重链。抗体专业知识讲座第12页1、单体分子结构抗体专业知识讲座第13页抗体专业知识讲座第14页抗体专业知识讲座第15页1.1、重链（heavychain，H链）氨基酸组成：420－440aa，分子量约50KD，两条重链之间由一对或一对以上二硫键相互连接可变区（variableregion，VH）恒变区（constrantregion）高变区（hypervariableregion）－CDR骨架区（frameworkregion）类型（class）抗体专业知识讲座第16页抗体专业知识讲座第17页重链高变区氨基酸残基位置31－37aa51－58aa84－91aa101－110aaHVR3FR1FR2FR3FR4HVR1HVR2VariabilityIndex257550100Aminoacidresidue150100500抗体专业知识讲座第18页重链类型γ－IgGμ－IgGα－IgGε－IgGδ－IgG重链类型决定免疫球蛋白（抗体）种类抗体专业知识讲座第19页1.2、轻链（lightchain，L链）氨基酸组成：213－214aa，分子量约为25KD。两条相同轻链其羧基端（C）靠二硫键分别与两条重链连接可变区（variableregion，VL）恒变区（constrantregion，CL）高变区（hypervariableregion）骨架区（frameworkregion）类型（type）抗体专业知识讲座第20页轻链高变区氨基酸残基位置26－32aa48－55aa90－95aaHVR3FR1FR2FR3FR4HVR1HVR2VariabilityIndex257550100Aminoacidresidue150100500抗体专业知识讲座第21页轻链类型κ（kappa型）λ（Lambda型）各类免疫球蛋白都有两型轻链分子给类免疫球蛋白轻链都是相同抗体专业知识讲座第22页两型轻链比较动物κλ人66％34％小鼠97％3％兔80％20％抗体专业知识讲座第23页1.3免疫球蛋白功效区

（domain）VH－VL抗体分子结合抗原所在部位CH1－CL遗传标识所在CH2抗体分子补体结合位点，与体活化相关CH3与抗体细胞亲细胞性相关铰链区（hingeregion）CH1与CH2之间，30aa；与抗体分子结构型改变相关抗体专业知识讲座第24页抗体专业知识讲座第25页抗体专业知识讲座第26页2、水解片段与生物学活性PapainFcFabPepsinFcPeptidesF(ab’)2抗体专业知识讲座第27页2.1Fab片段组成由一条完整轻链和N端1/2重链组成，分子量为45KD生物学活性结合抗原决定抗体分子特异性部位抗体专业知识讲座第28页2.2Fc片段组成由重链C端1/2组成，包含CH2和CH3两个功效区，分子量为50KD生物学活性1.抗体分子选择性经过胚胎2.补体活化3.决定抗体分子亲细胞性4.抗体分子经过粘膜进入外分泌液5.决定各类免疫球蛋白抗原特异性部位抗体专业知识讲座第29页3、免疫球蛋白特殊分子结构抗体专业知识讲座第30页3.1连接链（joiningchain，J链）为IgM和分泌型IgA所含有分子量为20KD多肽链富含半胱氨酸由产生IgM和IgA同一浆细胞所合成起稳定多聚体作用，以二硫键形式与免疫球蛋白Fc片段共价结合。抗体专业知识讲座第31页3.2分泌成份（secretorycomponent，SC）是分泌型IgA所特有一个特殊结构，分子量为60KD－70KD；由局部粘膜上皮细胞所合成，在IgA经过粘膜上皮细胞过程中SC与之结合形成份泌型二聚体；促进上皮细胞主动地从组织中吸收分泌型IgA可预防IgA在消化道内为蛋白酶所降解，使之发挥免疫作用。抗体专业知识讲座第32页JChainSecretoryPiece抗体专业知识讲座第33页3.3糖类（carbohydrate)免疫球蛋白是含糖量相当高蛋白质在抗体分泌过程中起着主要作用使免疫球蛋白分子易溶和含有预防其分解作用。抗体专业知识讲座第34页二、抗体多样性免疫球蛋白种类免疫球蛋白抗原决定簇抗体专业知识讲座第35页1、免疫球蛋白种类类（class）IgGIgMIgAIgDIgE亚类（subclass）IgG－IgG1，IgG2，IgG3，IgG4IgM－IgM1，IgM2IgA－IgA1，IgA2IgE、IgD未发觉亚类抗体专业知识讲座第36页抗体专业知识讲座第37页人和动物IgG亚类种IgG亚类马IgGa，IgGb，IgGc，IgG（B）IgG（T）a，IgG（T）b牛IgG1，IgG2，IgG2a，IgG2b绵羊IgG1，IgG1a，IgG2，IgG3猪IgG1，IgG2，IgG3，IgG4狗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c猫IgG1，IgG2，小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3鸡IgG1，IgG2，IgG3，鸭IgG1，IgG2，人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4抗体专业知识讲座第38页抗体专业知识讲座第39页型（type：轻链恒定区抗原性不一样Κ，λ型亚型（subtype）：依据λ型轻链N端恒定区上氨基酸差异若干亚型，如190位氨基酸亮氨酸精氨酸

154位氨基酸甘氨酸丝氨酸Κ型轻链无亚型抗体专业知识讲座第40页2、免疫球蛋白抗原决定簇同种型决定簇（isotypicdeterminants）同种异型决定簇（allotypicdeterminants)独特型决定簇（idiotypicdeterminants）抗体专业知识讲座第41页同种型决定簇（isotypicdeterminants）同一个属动物全部个体共同含有抗原特异性：同一个动物不一样个体之间同时存在不一样类型免疫球蛋白，不表现出抗原性，只是在异种动物之间才表现出抗原性；免疫球蛋白类、亚类、型、亚型等均为免疫球蛋白同种型；免疫球蛋白同种型抗原决定簇（表位）主要存在于C区。抗体专业知识讲座第42页同种异型决定簇（allotypicdeterminants)

在同一个动物不一样个体之间展现出抗原性：同种异型决定簇存在于IgG、IgA、IgE重链C区和K型轻链C区同种异型差异普通为1－4个氨基酸差异，是受等位基因控制所表现出特定抗原性。同种异性是IgG稳定遗传标识。抗体专业知识讲座第43页IgG同种异型（Gm）：已发觉25种G1m（1），G2m（23）、G3m（11）、G4m（4a）IgA同种异型（AM）：A2m（1）、A2m（2）IgE同种异型Em（1）轻链同种异型Km（1）、Km（2）、Km（3）。Λ型轻链无同种异型。抗体专业知识讲座第44页独特型决定簇（idiotypicdeterminants）由抗体分子可变区展现出抗原性。独特位（idiotope）：免疫球蛋白可变区内若干个抗原决定簇独特型在异种、同种异体、本身体内均可刺激产生对应抗体。陈为抗独特型抗体（anti－idiotypeantibody）抗体专业知识讲座第45页抗体专业知识讲座第46页三、抗体代谢IgG是五类免疫球蛋白中半衰期最长，而分解率又最低一类IgE分解率最高IgA合成率虽与IgG相同，不过分解率高，所以血清中浓度不高各亚类中代谢率也不完全相同，如IgG1，IgG2，IgG4半衰期基础一致，但IgG3则较短抗体专业知识讲座第47页抗体代谢抗体种类半衰期（天）血清浓度mg/dl合成率Mg/kg/dayIgG23100033IgA620024IgM51206-7IgD330.4IgE30.050.02抗体专业知识讲座第48页四、各类抗体特征与免疫生物学功效IgGIgMIgAIgDIgE抗体专业知识讲座第49页抗体专业知识讲座第50页IgDStructureMonomerTailpieceTailPiece抗体专业知识讲座第51页IgEStructureMonomerExtradomain(CH4)C4抗体专业知识讲座第52页1、IgGIgG是人和动物血清中含量最高免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白总量75％～80％IgG是介导体液免疫主要抗体，多以但体形式存在，沉降系数为7S，分子量为160000～180000IgG主要由脾脏和淋巴结中浆细胞产生，大个别存在于血清中，其余存在于组织液和淋巴液中。抗体专业知识讲座第53页IgG是唯一一个能够经过人（兔）胎盘抗体，所以在新生动物抗感染免疫中起着十分主要作用IgG是动物自然感染和人工主动免疫后，机体所产生主要抗体，在动物体内不但含量高，而且连续时间长。能够发挥抗菌、抗病毒、抗毒素以及抗肿瘤等免疫学活性，能调理、凝集和沉降抗原，但只在有足够分子存在并以正确构型积聚在抗原表面时才能结合补体。抗体专业知识讲座第54页IgGStructureMonomer(7S)IgG1,IgG2andIgG4IgG3抗体专业知识讲座第55页2、IgMIgM是动物机体首次体液免疫反应最早产生免疫球蛋白，其含量仅占血清10％左右；主要由血清和淋巴结中B细胞产生，分布于血清中。IgM是由五个单体组成五聚体，单体之间由J链连接，分子量为900KD左右，是全部免疫球蛋白中分子量最大，又称为巨球蛋白（macroglobulin），沉降系数为19S。抗体专业知识讲座第56页IgM在体内产生最早，但连续时间短，所以不是机体抗感染免疫主力，但在抗感染免疫早期，起着十分主要作用，也可经过检测IgM抗体进行疫情血清学早期诊疗IgM含有抗菌、抗病毒、中和毒素等免疫活性，因为其分子上含有多个抗原结合部位，所以他是一个高效能抗体，其杀菌、溶菌、溶血、调理及凝集作用均比IgG高抗体专业知识讲座第57页IgM也含有抗肿瘤作用IgM溶解红细胞功效较IgG高1000倍，调理作用能力较IgG高275倍，IgM8个分子就能杀灭一个细菌，IgG需2200个分子，结合补体能力也比IgG高抗体专业知识讲座第58页IgMStructurePentamer(19S)Extradomain(CH4)JchainC4JChain抗体专业知识讲座第59页3、IgAIgA以单体和二聚体两种分子形势存在，单体存在于血清中，称为血清型IgA，约占血清免疫球蛋白10％～20％；二聚体为分泌型IgA。分泌型IgA是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位粘膜固有层中浆细胞产生，两个单体由一个J链连接在一起在分泌型IgA分子上还结合有一条由粘膜上皮细胞分泌分泌成份（SC）分泌型IgA主要存在于消化道、呼吸道、生殖道外分泌液中以及初乳、唾液、泪液，另外在脑脊液、羊水、腹水、胸膜液中也含有IgA。抗体专业知识讲座第60页分泌型IgA对机体呼吸道、消化道等局部粘膜免疫起着相当主要作用，是机体粘膜免疫一道屏障，可抵抗经粘膜感染病原微生物。抗体专业知识讲座第61页IgAStructureSerum-monomerSecretions(sIgA)Dimer(11S)JchainSecretorycomponentJChainSecretoryPiece抗体专业知识讲座第62页4、IgEIgE是以单体分子形式存在，分子量为190000，其重链比γ链多一个功效区（CH4），此区是与细胞结合部位，IgE产生部位与分泌型IgA相同，是由呼吸道和消化道粘膜固有层中浆细胞产生，在血清中含量甚微。IgE是一个亲细胞性抗体，易于皮肤组织、肥大细胞、血液中嗜碱性粒细胞和血管内皮细胞结合，可介导I型过敏反应。IgE在抗寄生虫、一些真菌感染方面也有主要作用。抗体专业知识讲座第63页5、IgDIgD极少分泌，在血清中含量极低，而且不稳定，轻易降解。IgD分子量为170000～00。IgD主要作为成熟B细胞膜上抗原特异性受体，是B细胞主要表面标识。另外还认为IgD与免疫记忆相关，也有报道认为IgD与一些过敏反应相关。抗体专业知识讲座第64页五、抗体学说发展侧链学说诱导学说选择学说抗体专业知识讲座第65页1、侧链学说（sidechaintheory）他假定细菌毒素之所以能够发挥其毒素作用，系因为机体细胞表面含有一些sidechain，毒素能够与对应侧链结合，于是造成细胞破坏。这种结合是特异性和不可逆。只有毒素与侧链结合后能够脱离细胞，而且细胞又有再生新侧链，毒素作用才能够被解除（中和）依据代偿过剩法则，细胞可产生多量而过剩侧链，并将其释放血液中，即成为抗体，这种游离抗体，在血液中与毒素结合，便可将其中和，从而到达免疫效果。抗体专业知识讲座第66页2、诱导学说（Instructivetheory）直接模板学说（directtemplatetheory）1930年Breinl和Haurowits提出：主张蛋白质合成要以蛋白质为模板。在这个前提下，认为抗体产生必需以抗原为模板，抗体抗原结合部位是以抗原决定簇为模板而形成，抗原决定簇附着在细胞合成非抗体球蛋白部位，使球蛋白分子一级结构发生改变，使其产生出正常球蛋白所不含有新化学基团，并有与抗原决定簇互补结构。抗体专业知识讲座第67页Pauling（1940年）把直接模版学说深入详细化，他认为全部抗体都是球蛋白，其初级结构就是氨基酸排列次序。全部抗体初级结构完全相同，而不论其特异性怎样，这种排列次序决定于基因，球蛋白高级结构取决于多肽链折叠方式，所以只有高级结构才能决定抗体特异性，普通多肽链高级结构相同，组成所谓正常球蛋白，是比较稳定分子结构，如在形成球蛋白处附着有抗原时，即球蛋白高级结构即按抗原量折叠，因而可使抗体取得特异性。抗体专业知识讲座第68页间接模板学说（indirecttemplatetheory）

1949年Burnet和Fenner提出间接模板学说，认为抗原决定簇对基因发生影响，这么才能对免疫球蛋白分子表现出修饰作用。即抗原分子进入产生抗体细胞内，于是抗原决定簇便可形成基因型复制（genocopy）这种基因修饰不但可与细胞内继续存在，而且可随细胞而增殖，所以抗原不存在也能产生抗体。对于本身与非本身识别上，认为一切属于本身物质，都有本身标识（self－marker），识别单位能够对其加以识别，所以对本身物质不能发生免疫反应。因为在胚胎期内，全部属于本身物质都于是别单位相遇，如在此时注入非本身物质，机体也可将其按本身物质加以处理，出生后再碰到该抗原时不发生免疫反应，展现免疫耐受。抗体专业知识讲座第69页3、选择学说（Selectivetheory）自然选择学说（Naturalselectivetheory）

Jerne于1955年提出，认为：机体对任何抗原早已准备下了相同抗体（意即天然抗体），外来抗原如与某种自然抗体相对应时，便可与之结合，成为抗原抗体复合物。改种复合物被巨噬细胞吞噬后，可使抗原与抗体解离，抗原继续被酶溶解，剩下抗体便可在巨噬细胞内诱导产生与其含有一样特异性抗体。在抗体形成上，起主要作用是体内早已存在抗体。这种抗体在特异性抗原选择作用下，才能诱导吞噬细胞产生抗体。抗体专业知识讲座第70页克隆选择学说（Cloneselectivetheory）

受到Jerne自然选择学说影响，澳大利亚免疫学家Burnet毅然放弃其间接模板学说，而且引进了他在间接模板学说所主张基因致使细胞特异性概念

1957年发表了以“AmodificationofJernetheoryofantibodyproductionusingtheconceptofcloneselection”为题论文。

1959年出版了题为《Theclonalselectiontheoryofaquiredimmunity》专著，创建了举世闻名克隆选择学说。抗体专业知识讲座第71页基础思想该学说指出抗原选择不是游离抗体，而是事先存在于淋巴细胞膜表面抗原受体，即表面免疫球蛋白（SIg）动物体内存在大量淋巴细胞克隆