生物化学蛋白质

关于生物化学蛋白质一.蛋白质的酸碱性质各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。第2页,共72页，2024年2月25日，星期天二.蛋白质分子的大小与形状（一）根据化学组成测定最低相对分子质量假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。第3页,共72页，2024年2月25日，星期天例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu的百分含量计算，最低MrX1：X1=(100

131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量计算最低MrX2：X2=(100

131)/2.48=5282.3由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5

这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：7939.4

2=15878.8或5282.3×3=15846.9第4页,共72页，2024年2月25日，星期天（二）渗透压法测定相对分子质量第5页,共72页，2024年2月25日，星期天（三）沉降分析法测定相对分子质量第6页,共72页，2024年2月25日，星期天基本原理：⒈离心力（centrifugalforce，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：F=m*a=m*ω2ra—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。第7页,共72页，2024年2月25日，星期天⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。

。第8页,共72页，2024年2月25日，星期天G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２离心半径为10厘米，转速为8000，其离心力为：

G＝1.11*10-5*10*（8000）２＝7104

即离心力为7104g.而当离心力为8000g时，其转速应为：8489即约为8500rpm第9页,共72页，2024年2月25日，星期天⒊沉降系数（sedimentationcoefficient，s）：1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中移动的速度。S：沉降系数，时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。例如，动物原生质核糖体的沉降系数等于80S，它的含义就是：80×10-13s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。第10页,共72页，2024年2月25日，星期天第11页,共72页，2024年2月25日，星期天沉降法:又称超速离心法。基本原理：蛋白质分子在溶液中受到强大离心力的作用时，其密度大于溶剂而沉降。在沉降过程中，分子量相同的蛋白质颗粒以相同的速度沉降，在介质中会形成一条清晰的条带，用特制的光学仪器扫描记录，可以显示出所有蛋白质条带位置及沉降速度。物质颗粒在单位离心力场中的沉降速度为恒定值，称沉降系数，用S表示，一个S单位为1×10－13s。蛋白质的沉降系数S（20℃水中）大约为1×10－13-200×10－13s即1S-200S。用沉降法求出S值并计算出分子量。注意。文献中经常出现以S为单位描述蛋白质。第12页,共72页，2024年2月25日，星期天（四）凝胶过滤法测定相对分子质量

当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。第13页,共72页，2024年2月25日，星期天第14页,共72页，2024年2月25日，星期天若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。在实际应用中多以相对洗脱体积Kav(Kav=Ve/Vt)对lgMr作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。第15页,共72页，2024年2月25日，星期天第16页,共72页，2024年2月25日，星期天（五）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量

SDS即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与SDS总浓度、离子强度及温度有关，为了使单体和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物，需要采取低离子强度，使单体浓度有所升高。在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4gSDS/g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4gSDS/g蛋白质。第17页,共72页，2024年2月25日，星期天由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比。第18页,共72页，2024年2月25日，星期天

测定未知蛋白质Mr时，可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度，同时进行SDS，则可根据已知Mr蛋白质的电泳迁移率和Mr的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得Mr。它不仅用于蛋白质Mr测定，还可用于蛋白混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。第19页,共72页，2024年2月25日，星期天第20页,共72页，2024年2月25日，星期天第21页,共72页，2024年2月25日，星期天第22页,共72页，2024年2月25日，星期天三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）蛋白质的胶体性质大小在1-100nm范围内；同种电荷互相排斥；质点外围有水化层。（二）蛋白质的沉淀1.盐析法2.有机溶剂沉淀法3.重金属盐沉淀法4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法5.加热变性沉淀法第23页,共72页，2024年2月25日，星期天四、蛋白质分离纯化的一般原则1.前处理要选择合适的材料;合适的破碎方法;合适的提取液。2.粗分级分离要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。3.细分级分离主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。第24页,共72页，2024年2月25日，星期天五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1.透析和超滤(1)透析透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。

第25页,共72页，2024年2月25日，星期天第26页,共72页，2024年2月25日，星期天(2).超滤：利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。

超滤是一种膜分离技术第27页,共72页，2024年2月25日，星期天第28页,共72页，2024年2月25日，星期天2.密度梯度离心第29页,共72页，2024年2月25日，星期天第30页,共72页，2024年2月25日，星期天3.凝胶过滤

第31页,共72页，2024年2月25日，星期天(二)利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀和pH控制

利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。

第32页,共72页，2024年2月25日，星期天在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱。第33页,共72页，2024年2月25日，星期天2.蛋白质的盐溶和盐析定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。第34页,共72页，2024年2月25日，星期天第35页,共72页，2024年2月25日，星期天盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好稳定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。

第36页,共72页，2024年2月25日，星期天硫酸铵浓度的计算与调整方法

通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。

第37页,共72页，2024年2月25日，星期天用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：

（1）加入饱和溶液法要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液的体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。第38页,共72页，2024年2月25日，星期天(2)

加入固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1LS1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G和A为常数，与温度有关。实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃两张表，室温用25℃）第39页,共72页，2024年2月25日，星期天3.pH和温度对蛋白质溶解度的影响pH的影响

大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。第40页,共72页，2024年2月25日，星期天温度的影响

a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；

b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。一般在室温下进行盐析，温度敏感的蛋白质在低温4℃进行，也有个别酶在低温时失活，高温有活性，如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶解度低，更容易盐析。第41页,共72页，2024年2月25日，星期天4.有机溶剂分级分离法（1）作用机理：

a.降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；

b.破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。

利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。第42页,共72页，2024年2月25日，星期天（2）优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。（3）缺点：

有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。

有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。第43页,共72页，2024年2月25日，星期天第44页,共72页，2024年2月25日，星期天注意：（1)低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。（3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4)注意离子强度，离子种类的影响。第45页,共72页，2024年2月25日，星期天(三)根据电荷不同的纯化方法1.电泳

带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt式中，U(也可以用m表示)为泳动度(cm2/Vs)；v为颗粒泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；d为颗粒移动的距离；l为支持物的有效长度(cm)；V为实际电压(V)；t为通电时间(s或min)。电泳后通过侧量V,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度。

泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为：F=EQ式中，E为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q为被分离物所带净电荷。根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F′为：

F′=6πrηv式中，η为介质粘度，r为分子半径，v为分子移动速度。当平衡时：F=F′，即EQ=6πrηv∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关。第46页,共72页，2024年2月25日，星期天2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。

凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。TEMED的碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活Acr单体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成网状凝胶。碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5%的凝胶在pH8.8时30min聚合，在pH4.3时约需90min。此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。第47页,共72页，2024年2月25日，星期天第48页,共72页，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。(2)化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。(3)对pH和温度变化较稳定。(4)几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。(6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。第49页,共72页，2024年2月25日，星期天3.等电聚焦

蛋白质是两性电解质，当pH＞pI时带负电荷，在电场中向正极移动；当pH＜pI时带正电荷，在电场中向负极移动；当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectricfocusing,简释IEF)。第50页,共72页，2024年2月25日，星期天第51页,共72页，2024年2月25日，星期天4.双向电泳双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF，第二向为SDS-PAGE的双向分离技术，简称为IEF/SDS；基本原理与IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF，取出胶条用于第二向电泳。第一向电泳的方法同IEF，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素。第二向电泳时，先将SDS-PAG灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间，待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3μL1%溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制)密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳。待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时，停止电泳。第二向电泳时，用梯度混合器将凝胶制成7.5%-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。第52页,共72页，2024年2月25日，星期天第53页,共72页，2024年2月25日，星期天第54页,共72页，2024年2月25日，星期天5.毛细管电泳毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)是在毛细管中填充具线状缠结聚合物结构的物理凝胶，使样品中各组分通过净电荷差异和分子大小差异双重机制得以分离。CGE在蛋白质、多肽、DNA序列分析中得到成功应用，已成为生命科学基础和应用研究中有力的分析工具。近年来，其它类型的毛细管电色谱法(capillaryelectro-chromatography,CEC)发展很快。其中填充毛细管电色谱法(packedcolomnCEC)是将细粒径固定相填充在毛细管柱中，开管毛细管电色谱法(opentubolarCEC)是把固定相的官能团键合在毛细管内壁表面而形成的色谱柱。CEC是很有前途的分析方法。由于毛细管容易冷却，可以加很高的电压，因而，有很好的分辨率。可以通过记录仪直接检测，容易组合成自动化程度很高的成套仪器。第55页,共72页，2024年2月25日，星期天第56页,共72页，2024年2月25日，星期天6.层析聚焦层析柱中填装多缓冲交换剂，用多缓冲剂淋洗柱子可以形成pH梯度，淋洗液按照pH依次从柱中流出，蛋白质按pI依次从柱中流出，有较好的分离效果。第57页,共72页，2024年2月25日，星期天7.离子交换层析(1)离子交换剂离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基团共价键连接，电荷基团与反离子以离子键结合。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA++B+RB++A+

第58页,共72页，2024年2月25日，星期天

离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间的电荷相同时，离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力越大。第59页,共72页，2024年2月25日，星期天第60页,共72页，2024年2月25日，星期天(2)洗脱方法在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。梯度溶液按组成来分，一般有二种：一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；另一种是改变pH值的梯度溶液。该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，所用缓冲液的种类、pH值以及缓冲容量要认真选择，否则将达不到预期目的。对于增加离子强度的梯度溶液，不管用于何种类型的离子交换剂，其离子强度绝大部分是增加的。而改变pH值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减，实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定。第61页,共72页，2024年2月25日，星期天K=VM/VR第62页,共72页，2024年2月25日，星期天(四)利用选择性吸附的纯化方法1.羟基磷灰石层析羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(简称HA)]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的(PO4)3基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。第63页,共72页，2024年2月25日，星期天2.疏水作用层析

以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱。常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。第64页,共72页，2024年2月25日，星期天(五)利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。

具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。