高三生物一轮复习课件第41讲基因工程

第41讲

基因工程主要考点

必备知识考点一重组DNA技术的基本工具考点二基因工程的基本操作程序考点三实验：DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定考点四基因工程的应用和蛋白质工程考点一重组DNA技术的基本工具

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。1．基因工程的概念别名重组DNA技术、转基因技术操作环境操作对象操作水平结果原理特点主要在生物体外基因（DNA）DNA分子水平创造出人类需要的新的生物类型和生物产品基因重组定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限一、基因工程这种技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。2.不同种生物的基因能“拼接”的理论基础：①DNA都是由4种脱氧核苷酸组成3.目的基因在受体细胞内表达原因：地球上所有的生物共用一套密码子。遗传信息的传递都遵循中心法则②双链DNA空间结构都是规则的双螺旋结构4.基因重组还有哪些类型？减数分裂I前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换；减数分裂I后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。一、基因工程1.限制性内切核酸酶（内切酶）——“分子手术刀”

切割DNA分子的工具①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。②种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）二、基因工程的工具③作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。*确切来说应该是催化磷酸二酯键断开*该过程“特定”体现了酶的专一性*限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。④识别序列

大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或__________的核苷酸组成。648其他数量EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’*限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。二、基因工程的工具⑤切割结果DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——________和_______黏性末端平末端当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端当限制酶在它的识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端二、基因工程的工具*EcoRⅠ识别序列为GAATTC*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端*形成的黏性末端（从5’往3’读）为__________*一个限制酶切割一次形成_______个黏性末端*同一种限制酶切割形成的黏性末端_________*两个黏性末端有__________个游离的磷酸基团。AATT-两相同2二、基因工程的工具现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATC-AATT-AGCT-GATC-思考：你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端二、基因工程的工具现学现用：以下黏性末端是由__种限制酶作用产生的3思考：你从中发现什么现象了？相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的二、基因工程的工具种类E·coli

DNA连接酶T4DNA连接酶来源作用相同点大肠杆菌T4噬菌体只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）恢复的都是磷酸二酯键2.DNA连接酶——“分子缝合针”①.DNA连接酶作用：②.基因工程常用的DNA连接酶有两种：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，二、基因工程的工具两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！E·coliDNA连接酶的缝合作用二、基因工程的工具③.DNA连接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比较种类作用作用部位DNA连接酶DNA聚合酶限制酶DNA酶解旋酶连接两个DNA片段形成磷酸二酯键将单个的脱氧核苷酸连接的已有的核苷酸链上形成磷酸二酯键①识别特定脱氧核苷酸序列②有特定的切割位点破坏磷酸二酯键催化DNA水解为脱氧核苷酸破坏磷酸二酯键解开DNA的双螺旋结构破坏氢键二、基因工程的工具①作用：作为运输工具，携带外源DNA片段进入受体细胞中3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”③最常用的载体——质粒:（1）本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子

。（真核生物酵母菌细胞）二、基因工程的工具②种类：质粒、噬菌体、动植物病毒（2）质粒作为载体需具备的条件（2）有一个至多个限制酶切割位点，以便插入（携带）目的基因。（可携带多个或多种外源基因）（3）具有某些标记基因，以便鉴定和筛选出含目的基因的受体细胞。（4）对宿主细胞无害。标记基因的筛选原理：

一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。二、基因工程的工具基因工程的工具限制酶①主要存在于原核生物中②具有专一性(识别序列)③切开DNA分子的磷酸二酯键④产生黏末端或平末端DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒载体具备的条件①能在宿主细胞中自我复制②并稳定存在③具一种至多种限制酶切点④具标记基因小结考点二

基因工程的基本操作程序苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子【培育转基因抗虫棉的简要过程】1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定

基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。（核心步骤）1.目的基因（1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物

等的基因。（2）作用:根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要指编码蛋白质的基因。一、目的基因的筛选与获取从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一2.筛选合适的目的基因3.获取目的基因的方法⑵从_________中获取从____________中获取从部分基因文库(如cDNA文库)中获取基因文库基因组文库⑴用_____方法直接人工合成条件：基因比较小，

已知方法：通过___________用化学方法直接

人工合成化学核苷酸序列DNA合成仪⑶利用PCR技术扩增目的基因

概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列①一、目的基因的筛选与获取3.获取目的基因的方法⑶利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪②PCR的条件：

目的基因DNA(模板)、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）

控制温度变化引物是一小段能与________的一段碱基序列________的___________。用于PCR的引物有

种，长度通常为20~30个核苷酸。DNA母链互补配对短单链核酸2

前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物结合在模板链的3’端一、目的基因的筛选与获取⑶利用PCR技术扩增目的基因3′5′子链的延伸方向是5′→3′？DNA聚合酶3′5′模板链子链因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端子链合成需要引物？一、目的基因的筛选与获取⑶利用PCR技术扩增目的基因3’5’3’5’3’5’3’5’①变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链②复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合③延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一、目的基因的筛选与获取⑶利用PCR技术扩增目的基因③过程：1）变性：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA90℃变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

碱基互补配对3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃为什么温度要上升至72℃？Taq酶结合在引物的3’还是5’端？

72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端一、目的基因的筛选与获取第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’④PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。

由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。

即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。一、目的基因的筛选与获取5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’思考获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？至少要三次循环。第一轮产生的子链长度小于模板链长度，到第三轮循环时，才出现2个两条脱氧核苷酸链等于目的基因。一、目的基因的筛选与获取复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？

复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之问的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。思考一、目的基因的筛选与获取【补充】基因的结构DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遗传效应的DNA片段能编码特定的蛋白质非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游能转录相应的mRNA进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子连续的、不间隔的非编码区：含有能调控遗传信息表达的DNA序列不转录，不编码蛋白质RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；本质：位置：作用：也是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游间隔的、不连续的外显子：内含子：数量关系：外显子=内含子+1能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列转录初级RNA成熟mRNA非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345启动子终止子【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？剪切、拼接DNA聚合酶单链DNAcDNA逆转录酶逆转录复制不含非编码序列。即不含非编码区和内含子【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码1.构建基因表达载体的目的：2.基因表达载体的组成思考：要各个元件有什么作用？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。01目的基因的筛选与获取二、基因表达载体的构建——核心步骤目的基因：编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子。启动子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA复制原点：DNA复制的起始位点终止子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录四环素抗性基因、荧光蛋白基因等标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来二、基因表达载体的构建——核心步骤载体≠表达载体：1.二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。2.表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】特殊序列结构的DNA片段位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点本身不转录决定氨基酸不决定氨基酸二、基因表达载体的构建——核心步骤基因表达载体3.基因表达载体的构建过程同种限制酶或能产生相同末端的限制酶二、基因表达载体的构建——核心步骤①首先用一定的

切割载体（质粒），使它出现一个切口。②然后用

限制酶或能产生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③再利用

将含目的基因的DNA片段拼接到

的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。限制酶同种相同DNA连接酶载体载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种培育抗虫棉的简要过程使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？问题探讨载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1如何解决这一问题？

选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。二、基因表达载体的构建——核心步骤（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选。若被破坏，无法进一步筛选。思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？二、基因表达载体的构建——核心步骤（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？如果能，有何弊端？能①质粒、目的基因会发生自身环化连接；②会发生两两自身连接；③质粒与目的基因会发生反向连接。思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？二、基因表达载体的构建——核心步骤（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；②还可以防止目的基因与载体的反向连接。思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？二、基因表达载体的构建——核心步骤（1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。二、基因表达载体的构建——核心步骤（3）确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。（4）保证目的基因和质粒发生定向连接将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创（常用）三、将目的基因导入受体细胞②在植物授粉后一定时间内，剪去

，将DNA溶液滴在

，使目的基因通过

进入

。①用微量注射器将

溶液直接注入

中；花粉管通道法导入外源DNA（1）花粉管通道法（我国独创）1.目的基因导入植物细胞含目的基因DNA子房柱头花柱切面花粉管通道胚囊①转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。（2）农杆菌转化法1.目的基因导入植物细胞②原理：

农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的

转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的

上。Ti质粒T-DNA染色体DNA可转移的DNA三、将目的基因导入受体细胞46目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达③过程：（2）农杆菌转化法目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中重组DNA转入农杆菌农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中目的基因遗传特性稳定维持和表达三、将目的基因导入受体细胞该过程经过____次拼接、____次导入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：

______________________________________________________________③第一次导入：__________________________________④第二次导入：__________________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌农杆菌将含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）三、将目的基因导入受体细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物2.将目的基因导入动物细胞（移植到同期发情的母畜子宫内）三、将目的基因导入受体细胞（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）（2）受体细胞：Ca2+感受态细胞吸收3.将目的基因导入微生物细胞使用Ca2+处理：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）三、将目的基因导入受体细胞小结：将目的基因导入受体细胞的方法种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞

在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉PCR等技术检测抗原—抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）四、目的基因的检测与鉴定PCR技术PCR技术抗原—抗体杂交杂交带检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。四、目的基因的检测与鉴定考点三

实验：DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。（分离提取DNA）DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（溶解提纯DNA）1.实验原理（2）鉴定原理（1）提取原理在一定温度下（在沸水浴条件下），DNA遇二苯胺，会出现蓝色。一、DNA的粗提取与鉴定DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。（1）选材：（2）试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——析出DNA——溶解DNA2.材料用具——破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNA稳定，提高DNA溶解度——鉴定DNA，要现配现用,用棕色瓶保存。鉴定时需沸水浴加热5分钟，溶液的蓝色的深浅与溶液中DNA含量的多少相关。——滴入NaCl溶液中，使浓度下降至0.14mol/L，析出DNA一、DNA的粗提取与鉴定（1）研磨洋葱

称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）过滤获取含DNA的上清液

方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，取上清液。

方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，取上清液。3.方法步骤思考：过滤能否用滤纸代替纱布？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，最终影响提取的DNA量。一、DNA的粗提取与鉴定（3）析出DNA方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌（避免破坏DNA），卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；加入预冷酒精一、DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤（3）析出DNA方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。离心弃上清液一、DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤（4）DNA的鉴定试管编号对照组实验组步骤12mol/L的NaCl溶液2mol/L的NaCl溶液步骤2不进行任何处理加丝状物或沉淀步骤3加4mL二苯胺，混匀加4mL二苯胺，混匀步骤4沸水浴5min沸水浴5min实验现象溶液不变蓝色溶液逐渐变成蓝色实验结论DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色一、DNA的粗提取与鉴定3.方法步骤取上清液充分研磨纱布过滤95%冷酒精离心离心丝状物沉淀物(1)以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止

。血液凝固(2)利用动物细胞提取DNA时动物细胞无细胞壁，可使其

。(3)不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞

。无细胞核吸水涨破4.操作提示一、DNA的粗提取与鉴定1.实验原理（1）原理①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；热变性调节温度自动调控温度30②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；二、DNA片段的扩增PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL总体积50μL注：模板DNA的用量为1gp～1μg①加液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分2.方法步骤二、DNA片段的扩增②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。2.方法步骤二、DNA片段的扩增1.原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些_______会向着________________的电极移动，这个过程就是_____。可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反②PCR的产物一般通过_______________来鉴定琼脂糖凝胶电泳④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。染色300nm紫外灯③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关。凝胶的浓度DNA分子的大小构象三、DNA片段的电泳鉴定①配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀②制备凝胶A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。三、DNA片段的电泳鉴定2.方法步骤③加样

：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物④电泳：

接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳⑤观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相三、DNA片段的电泳鉴定2.方法步骤注意:①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。三、DNA片段的电泳鉴定3.结果分析与评价(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。

如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。三、DNA片段的电泳鉴定考点四基因工程的应用和蛋白质工程1.基因工程在农牧业方面的应用抗虫功能的基因抗病基因降解或抵抗一、基因工程的应用蛋白质编码基因花青素代谢相关的基因外源生长激素基因乳糖酶基因乳汁1.基因工程在农牧业方面的应用一、基因工程的应用2.基因工程在医药卫生领域的应用基因改造显微注射抗原决定基因克隆免疫排斥一、基因工程的应用工程菌牛凝乳酶的基因基因工程菌3.基因工程在食品工业方面的应用一、基因工程的应用基因工程外源基因高效表达基因工程构建基因工程菌工业发酵批量生产1概念：2步骤：3应用：用_________的方法，使_________得到__________的菌类，一般称为基因工程菌利用基因工程菌，除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等基因工程菌一、基因工程的应用蛋白质工程