进展-细胞凋亡

细胞凋亡项荣

shirlesmile@中南大学生物科学与技术学院左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞2002年诺贝尔生理与医学奖获得者悉尼·布雷诺尔、罗伯特·霍维茨和约翰·苏尔斯顿器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡细胞凋亡的研究历史

1.

凋亡概念的形成和形态学的研究(1972）

1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apoptosis)的概念。宣告了对细胞凋亡真正探索的开始。2．DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与(1987）3.蛋白质水解酶活化的研究(1995)4.细胞膜的变化(1997)5.线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-)1）相关基因及调控

2）信号转导

3）各种分子及其相互作用、相互关系

4）疾病机制的阐明，疾病新疗法的探索及问世ApoptosisIMPACTFACTOR(2010):3.421Apoptosisisaninternationalpeer-reviewedjournaldevotedtotherapidpublicationofinnovativebasicandclinically-orientedinvestigationsintoprogrammedcelldeath.Itaimstostimulateresearchonthebasisofmechanismsofapoptosisandonitsroleinvarioushumandiseaseprocessesincluding:cancer,autoimmunedisease,viralinfection,AIDS,cardiovasculardisease,neurodegenerativedisorders,osteoporosisandageing.Theeditorsintendtoencouragethedevelopmentofclinicaltherapiesagainstapoptosis-relateddiseases.Apoptosis

Apo从…ptosis

飘零，落下细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式

细胞凋亡(Apoptosis)一、细胞凋亡的概念及其生物学意义二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征三、细胞凋亡的分子调控机理四、细胞凋亡与疾病一、细胞凋亡的概念及其生物学意义概念：生理或病理情况下，发生在机体内的，一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，即“主动性细胞自杀”过程。所以也常常被称为细胞编程死亡（programmedcelldeath，PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬

生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用

二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征（一）细胞凋亡与坏死（二）细胞凋亡的形态学特征（三）细胞凋亡的生化特征（四）诱导细胞凋亡的因子（五）细胞凋亡的检测（一）细胞凋亡与坏死

细胞坏死(CellNecrosis)：细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。坏死细胞的形态改变主要是由酶性消化和蛋白变性的病理过程引起。参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）。初期胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂中期随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，导致细胞结构完全消失，末期细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应坏死细胞的形态改变细胞坏死与凋亡的形态区别

细胞凋亡和细胞坏死病理因素导致的细胞膜失去完整性的细胞死亡为坏死。生理或病理条件下基因控制的细胞膜保持完整的细胞死亡为凋亡。（二）细胞凋亡的形态学特征

◆凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布

◆凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体 ◆凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化凋亡细胞早期细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构凋亡细胞中期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化凋亡细胞晚期细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：早期的细胞核呈波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；中期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；晚期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（三）细胞凋亡的生化特征◆凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG

（tissueTransglutaminase）积累并达 到较高水平◆细胞凋亡的主要特征形成大小为180～200bp特征性的DNAladders

细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker

？（四）诱导细胞凋亡的因子

◆物理性因子，包括射线（紫外线，

射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA

和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子

（TNF

），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等1.细胞凋亡的形态学检测2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）3.线粒体膜势能（

mt）的检测4.DNA片断化检测

5.TUNEL法6.Caspase-3活性的检测

7.WB检测8.凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析

（五）细胞凋亡的检测

1.细胞凋亡的形态学检测

光学显微镜和倒置显微镜

未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Hoechst33342;

Hoechst33258;DAPI。电子显微镜观察电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。2.磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35

36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemediumApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI流式细胞分析DNA根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。

3.线粒体膜势能（

mt）的检测

线粒体荧光染料：Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。线粒体跨膜电位的存在使亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

4.DNA片段化分析

细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180

200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。5.TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）6.Caspase-3活性的检测荧光物质偶联的短肽活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键7.WB8.凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析

三、细胞凋亡的分子调控机理

●线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 1.Caspase家族与凋亡

2.Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡3.细胞凋亡的信号转导通路1.Caspase家族与凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化caspase

超家族成员及其相应底物Caspase活化

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化2.Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡◆Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3 ◆Bcl-2、线粒体与细胞凋亡 ◆哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC◆当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起细胞凋亡BCL-2家族成员3.细胞凋亡的信号转导通路当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡·下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;

裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂等重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。三条细胞凋亡信号通路

PathwayofApoptosis死亡受体信号途径(death-inducingsignalingcomplex)

TNFR1/TNFα、DR4/TRAIL、DR5/TRAIL

DeathReceptor-mediatedPathway线粒体凋亡信号途径

MitochondrialPathway内质网凋亡信号途径EndoplasmicReticulumialPathway凋亡信号的网络式转导(一)死亡受体通路和线粒体通路的交叉

(ExchangebetweenDeathReceptor-mediatedPathwayandMitochondrialPathway)凋亡信号的网络式转导(二)死亡受体通路与内质网通路的“相互对话”Cross-talkbetweenDeathReceptor-mediatedPathwayandERpathway线粒体和内质网间凋亡信号的持续放大凋亡信号的网络式转导(三)Cross-talkbetweenMitochondrialPathwayandERPathway过表达RTN3介导了细胞凋亡的三条基本信号转导途径凋亡信号转导系统特点①多样性：不同种类的细胞系统不同②偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联③同一性：多因素，共用同一系统触发④多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径氧化损伤钙稳态失衡线粒体损伤恶性网络假说(deleteriousnetworkhypothesis)

细胞凋亡Δ

Ψm↓

AIF，ApafPTPopen细胞凋亡与程序性细胞死亡（ApoptosisandProgrammedCellDeath）PCD是功能性概念，表示基因调控细胞死亡这一功能；而Apoptosis为形态学概念，是对一系列凋亡特征性、形态、生化变化的概括。PCD主要由Apoptosis引起，但还有其它的多种机制；同样，Apoptosis既有程序性部分，又有非程序性部分存在。PCD仅存在于发育细胞中，而Apoptosis既可发生于发育中的细胞，也可发生于成体细胞如肿瘤细胞等。

一种新型的细胞死亡机制：副细胞凋亡（Paraptosis）

形态上，当细胞发生Paraptosis时，细胞体积变大，细胞膜完整，电子显微镜下可见细胞内出现大量由线粒体和内质网肿胀形成的胞浆空泡。Paraptosis在生化机理方面与凋亡不同，它是TUNEL阴性的；Caspase抑制剂和Bcl-XL超表达不能阻断它；它可被酶活性缺失的Caspase-9突变体所诱导，并且是Apaf-1非依赖的；丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、胰岛素样生长因子Ⅰ受体和TNF受体家族成员TAJ/TROY可诱发它的发生；而AIP1/Alix作为一种能和细胞中的钙结合死亡相关蛋白ALG-2相互作用的蛋白，抑制它的发生。一种新的癌细胞死亡：oncosis

胀亡的形态学特征是细胞肿胀，体积增大，胞浆空泡化，肿胀波及细胞核、内质网、线粒体等胞内结构，胞膜起泡，细胞膜完整性破坏。oncosisapoptosis胞浆肿胀胞浆萎缩核溶解性死亡核固缩膜泡中无亚细胞器膜泡中常有亚细胞器胀亡细胞周围由于胞内容物的外溢而引起炎症反应凋亡细胞周围多无炎症反应两种死亡方式并存，且在一定条件下可转换四、细胞凋亡与疾病㈠细胞凋亡不足1．肿瘤Bcl-2表达↑

P53突变或缺失2、自身免疫疾病

——胸腺对T细胞正负选择障碍正选择：与非已抗原-MHC抗原结合的TCR的单阳性细胞保留存活，进入外周T细胞库负选择：与自身抗原-MHC抗原结合的TCR的双阳性细胞被凋亡清除㈡细胞凋亡过度1．心血管疾病：（1）心肌缺血和心脏缺血再灌注损伤（IRI）：坏死+凋亡心肌缺血和IRI凋亡特点①缺血早期多②梗死灶周边多③轻度缺血多④IRI比单纯缺血多⑤慢性轻度缺血多凋亡机制①氧化应激：SOD可减轻②受体Fas上调：Fasl反应③P53激活:卡点作用（2）心力衰竭：心肌肥大的同时心肌数量减少（凋亡）凋亡指数：由对照0.2~0.4%→35%2．神经元退行性疾病Alzheimerdisease,AD——神经元丧失；海马及基底核的胆碱能神经元丧失达30%~50%，累及大脑皮层老年性痴呆与细胞凋亡老年性痴呆神经病理学和神经生化改变神经元细胞减少神经元纤维缠结神经炎症脑内免疫炎症细胞凋亡IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、TNFICE白介素-1β转换酶基因AD机制：致病因素（如氧自由基）作用于神经元，Ca2+内流↑，激活有关基因，促使神经元内β-淀粉样蛋白含量↑，从而导致凋亡3．病毒感染

HIV引起AIDS：CD4+细胞被选择性破坏CD4+淋巴细胞凋