大实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究本实验为学生提供一个较全面的实践时机，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。实验原理及相关知识蔗糖酶的介绍自1860年Bertholet从酒酵母SacchacomycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶〔invertase〕〔fructofuranosidefructohydrolase〕〔EC..26〕特异地催化非复原糖中的—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。〔2〕。实验原理：本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶〔externalyeastinvertase〕,其活力占蔗糖酶活力的大局部，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶〔internalyeastinvertase〕，含有少量的糖。两种酶的蛋白质局部均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差异，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。两种酶的性质对照表如下：名称MW糖含量亚基底物为蔗糖的Km底物为棉子糖的Km等电点pI最适pH稳定pH范围最适温度外酶27万(22万)50%双26mM150mM5.04.9(3.5～5.5)3.0～7.560内酶13.5万＜3%双25mM150mM4.5(3.5～5.5)6.0～9.0实验中，用测定生成复原糖〔葡萄糖〕的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。本实验共有以下分实验：一、蔗糖酶的提取与局部纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反响时间对产物形成的影响〔一〕蔗糖酶的提取与局部纯化：一、实验目的：学习酶的纯化方法。二、试剂：面包酵母二氧化硅蒸馏水〔使用前冷至4℃左右〕冰盐浴1N乙酸95%四、操作步骤：1.提取〔1〕称取5g干酵母，称10g二氧化硅，放入研钵中。〔2〕量取预冷的蒸馏水30ml缓慢参加酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时可以用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大局部研碎。〔3〕将混合物转入离心管中，平衡后，用离心机离心，4000rpm，30min。如果上层白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层脂肪层弃去。〔4〕用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，注意不要取沉淀，将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余局部转入清洁离心管中。〔8〕用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I〞。2.热处理〔1〕预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温〔2〕取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4000rpm，离心30min。〔3〕将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量〔称为“热级分II〞〕。3.乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴〔没有水的碎冰撒入少量食盐〕，逐滴参加等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。4000rpm，离心30min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存〔称为“醇级分Ⅲ废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性〔于下一个实验一起做〕。4.酶活力的测定利用旋光仪进行操作，一致的位置，再从度盘上读数。读数是正的为右旋物质，读数是负的为左旋物质。将旋光仪接于220V交流电源。开启电源开关，约5分钟后钠光灯发光正常，就可开始工作。(2)检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加上该偏差值。或放松度盘盖反面四只螺钉，微微转动度盘盖校正之(只能校正0.5°左右的误差，严重的应送制造厂检修)。(3)选取长度适宜的试管，注满待测试液，装上橡皮圈，旋上螺帽，直至不漏水为止。螺帽不宜旋得太紧，否那么护片玻璃会引起应力，影响读数正确性。然后将试管两头剩余溶液揩干，以免影响观察清晰度及测定精度。〔4〕按下表各组分配置溶液，注满试管，如有气泡，那么把气泡移到中间，在进行测定。管数IIIIIIIV酶液0.5ml乙酸缓冲液(0.2mol/LpH4.9)1.51.51.51.5H2O〔ml〕5555蔗糖0.05M(ml)3333旋光值α转化率〔%〕转化率〔%〕X15000MX0.01L(5)测定旋光读数:转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度，测定后，将实验数据记录下来，此为该酶的酶活力。5.蛋白含量的测定利用分光光度法进行蛋白含量的测定。分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长〔λ〕为横坐标，吸收强度〔A〕为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。测定样品蛋白含量应由同学预先测出牛血清蛋白浓度与分光光度仪读数的关系曲线，供其他同学对应曲线直接根据读数算出蛋白浓度。二〕离子交换柱层析纯化蔗糖酶一．离子交换层析实验原理及相关知识离子交换层析〔IonExchangeChromatography简称为IEC〕是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组别离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差异而进行别离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的别离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。二、操作步骤装柱与平衡：先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。上样与洗脱：上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl缓冲液〔A液〕和含0.2mol/L浓度NaCl的0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl缓冲液〔B液〕，进行线性梯度洗脱。用A液充分溶解醇级分Ⅲ。取1.5ml上清液〔即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量〕，将剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意收集，每管2.5~3.0ml/10min。上样后用A液洗两次，然后再用A液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液〔用B液〕，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速2.5~3.0ml/10min。4.各管洗脱液酶活力的定性测定在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/LpH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反响5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“+〞号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2~3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分IV〞。注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。在同一张图上画出所有管的酶活力和光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。三、尿糖的检测在点滴板上每一个孔内加一滴0.2mol/LpH4.9的乙酸缓冲溶液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反响5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的的变化。用“+〞号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。四、〔三〕蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定一、实验目的：掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。二、原理为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用旋光法。蔗糖水解转化率测定方法的建立本实验中反响物和生成物均具有旋光性，且旋光能力不同，故可采用体系在反响过程中旋光度变化来量度反响的转化率。计算用的旋光值由如下公式求出：α=+式中：α—旋光值X—蔗糖摩尔浓度〔mol/L〕Y—转化率100〔%〕实验测旋光值的方法为：分别配制转化率从0-1的转化糖浆，用旋光仪测出旋光值。0.015M蔗糖水解转化率理论曲线及实验验证表转化率%计算得旋光值转化率%计算得旋光值00.341500.12750.320550.106100.298600.085150.277650.063200.256700.042250.234750.021300.21380-0.0009350.19285-0.022400.17090-0.044450.14995-0.065100-0.086各级分蛋白质含量的测定采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。标准蛋白的取样量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到1.0ml。柱级分IV酶活力的测定计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表：为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一局部量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。〔一〕.实验数据记录及处理：1.酶的纯化表如下：级分记录体积(ml)蛋白质(mg/ml)总蛋白(mg)Units/ml总Units比活Units/mg纯化倍数回收率%Ⅰ19.217.1412,46791279.82.891.092,43Ⅱ17.03.6245.85851033.24.201.190.47Ⅲ30.81.81105.08101.5542.35.161.378.37Ⅳ3.56.3813.57120.5647.57.501.854.86［注］：一个酶活力单位Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1mol蔗糖水解所需的酶量。2.各级份蔗糖酶活性测定：管数IIIIIIIV酶液0.5ml乙酸缓冲液(0.2mol/LpH4.9)1.51.51.51.5H2O〔ml〕5555蔗糖0.05M(ml)3333旋光值α0.3350.1160.286-0.141转化率〔%〕0.7630.7860.7680.813转化率〔%〕X15000MX0.01L114.45117.9115.2121.953．各级份蛋白含量的计算：级分粗级分Ⅰ热级分Ⅱ醇级分Ⅲ柱级分ⅣA2801.340.8040.6880.663稀释倍数10101010蛋白浓度0.8910.2110.0590.026蛋白质浓度〔μg/ml〕4．酶活力的鉴定：原始酶液体积〔ml〕粗级分Ⅰ热级分Ⅱ醇级分Ⅲ柱级分ⅣA650E’(μmol/min.ml)A650E’(μmol/min.ml)A650E’(μmol/min.ml)A650E’(μmol/min.ml)0.500.335790.286850.116101.5-0.141121.5//////5.校正体积计算：级分记录体积ml核正体积计算取样体积ml校正后体积mlⅠ19.219.21.519.2Ⅱ17.011.4×〔19.2／13.7〕1.516.0Ⅲ30.830.8×〔19.2／13.7〕×〔11.4／9.9〕1.549.6Ⅳ3.53.5×〔19.2／13.7〕×〔11.4／9.9〕×〔30.80／3.5〕——6.386.离子交换层析洗脱液浓度曲线如下：7.尿糖试纸测酶活性实验结果如下：试管①试管②试管③试管④+++++++〔二〕结果讨论和实验心得：误差分析：〔1〕研磨不够充分，离心后管中脂肪层很薄。〔2〕测量体积时可能会出现读书误差。〔3〕在测定吸光值时，需先将分光光度计翻开预热，目的是稳定它的波长；因为测量数据是分两步进行的，所以最好用同一台仪器测定。4〕使用紫外分光仪测蛋白含量时，换样时比色皿清洗不干净或比色皿中残留蒸馏水较多，使待测样品更加稀释。讨论与心得：〔1〕严谨的实验态度和小组