扶正软坚散结法对甲状腺功能减退大鼠心肌肌球蛋白重链和mrna表达的影响

扶正软坚散结法对甲状腺功能减退大鼠心肌肌球蛋白重链和mrna表达的影响

甲状腺功能减退（hyp-i）是由多种原因引起的一过性疾病引起的。近年来,甲减性心脏病的报道日益增多。肌球蛋白作为心肌的主要收缩蛋白,其重链分为α和β两种型,即α-MHC和β-MHC,其重链基因是甲状腺激素TH调节的重要靶基因。原发性甲状腺功能减退症应归属于祖国医学的虚劳范畴,所谓“内伤脾胃,百病由生”,可见脾虚是各种虚证发生之源。导师多年临床经验发现甲减发病之初多存在脾气虚,因气虚无力行血,而兼见血瘀证,“气虚为阳虚之渐,阳虚为气虚之甚”,若阳虚水湿不化,则聚而生痰,痰气、瘀血结于颈前则发为瘿瘤。故治疗上从扶正软坚散结的角度,自拟方剂芪贝复元饮,太子参、黄芪补脾益气,浙贝母、夏枯草、制鳖甲等软坚散结。我们前期研究发现补中益气法对甲减大鼠心肌细胞的损伤具有修复作用,可以明显降低甲减大鼠血清CK、CK-MB水平,提高甲减鼠血清T3水平,但对甲减心肌损伤的改善是否与调节肌球蛋白重链α和β基因表达有关未见报告。故本实验重点研究在补中益气的基础上加用软坚散结的中药治疗甲减,探讨扶正软坚散结法对甲状腺功能减退大鼠心肌肌球蛋白重链α和β(后简称α-MHC和β-MHC)mRNA的表达的影响,为进一步证实中药对甲减心肌损伤的修复及其作用机制奠定基础。1生物资料来源4周龄清洁级Wistar大鼠120只,体重90~120g,雌雄各半,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2009-0004。1.2.1低碘饲料的制备由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。根据卫生部地方病调查、中国医科大学流行病学结果以及承德市地方病研究所提供的资料,采用全国重度缺碘地区河北省承德市隆化县大两间房村的玉米、谷子、黄豆,按73:20:7的比例,加入适量的添加剂(每100g饲料添加CaCO30.5g,Na2HPO40.15g,MnSO450mg,维生素B66mg,维生素B120.05mg,泛酸钙5.5mg,叶酸0.1mg,CoCl24.95μg,宝力维他20mg,酵母粉1g),由沈阳市于洪区前民实验动物饲料加工厂制成低碘饲料,其碘含量为20μg/kg。1.3仪器和试剂血清TT3、TT4放免试剂盒(北京赛博润特科技发展中心提供)、血清TSH测定试剂盒(RapidBio公司)、cDNA合成试剂盒(宝生物工程大连有限公司)、荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)、TriozolReagent(美国InvitrogenLifetechnologies公司)、4%多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)、2.5%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)、20%乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司)、PBS缓冲液(国药集团化学试剂有限公司)、高氯酸钠(化学纯,国药集团化学试剂有限公司)、左旋甲状腺素钠片(德国默克公司)。1.4u3000仪器小型台式离心机(美国SIGMA,1-13)、高速冷冻离心机sigma31k5C型(美国)、PCR扩增仪(德国Biometra)、紫外分光光度计(英国UV-visibleSpectrometer,UV300)、ABI7500扩增仪、DK-8B型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)、BIO-DAD680酶标仪、FJ-2008PSγ记数仪、切片机(德国Leica公司)、心电图机(日本光电)、DS-671型电子秤(上海寺冈电子有限公司)、代谢笼(苏州市实验试剂玻璃仪器厂)、灌胃器(沈阳市实验试剂玻璃仪器厂)。2动物心肌梗死时间和数量碘缺乏动物造模方法按照Kolaja法制作,选用4周龄清洁级Wistar大鼠(90~120g),雌雄各半,每天饲以低碘饲料,同时喂含1%高氯酸钠的双蒸水19天,续喂双蒸水2天,造模成功后将实验组随机分成3组,即模型对照组、L-T4组、芪贝复元饮组,每组30只。处理因素:正常对照组:饲以普通饲料,每只鼠每天灌服4mL双蒸水。模型对照组:低碘饮食,每日灌服4mL双蒸水。L-T4组:低碘饮食,每天灌服2mL含0.52μg/kg左旋甲状腺素钠片的混悬液(根据体重约1~2周增加0.52μg/kg),并灌服等体积的双蒸水。芪贝复元饮组:低碘饮食,每天灌服2mL含生药量29.9g/kg的芪贝复元饮(按人的常规日处方剂量,按与人相同体表面积折算),并灌服等体积的双蒸水。动物处死时间和数量:分别在给处理因素后的0、56天处死动物,每组每次相应处死12只动物。处死前1天,将大鼠放入代谢笼中,留24h空腹尿,吸取3~5mL,放入5mLeppendoff管中,-20℃冰柜中保存,用于尿碘测定。处死前称体重,20%乌拉坦腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,3000r/min离心10min,血清存入1.5mLeppendoff管中,-20℃冰柜中保存待测TT3、TT4、TSH。处死后迅速摘取心脏,用预冷的生理盐水冲净心腔内残余血,滤纸吸净后称质量,取左心室心肌组织两块,一块放入1.5mLeppendoff管中,滴入1mLTrizol试剂,-80℃保存,用于实时定量PCR的检测;一块于4%的多聚甲醛中固定,用于光镜标本的制作。血清促甲状腺激素(TSH)测定采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法(ELISA法),RapidBio试剂盒。血清总T3(TT3)、总T4(TT4)采用放射免疫分析法(RIA法)。采用中华人民共和国卫生部行业标准砷铈分光光度法。各组随机抽取6只大鼠,于处死前1天乙醚麻醉,针状电极刺入大鼠上下肢内侧皮下,用心电图机记录肢体导联心电图,走纸速度50mm/s,标定电压1mV=10mm。称取大鼠体质量和心脏质量,计算心脏的脏器指数(脏器指数是指某脏器质量与体质量的比值,常以每100g体质量计算)。迅速摘取心脏,用预冷的生理盐水冲净心腔内残余血,取左心室心肌组织于4%多聚甲醛中固定,常规石蜡包埋,5μm厚切片,进行HE染色,光镜观察。2.8实时定量rt-pcr心肌细胞总RNA的提取:于左心室取0.1g心肌组织,总RNA提取方法按照TriozolReagent(美国InvitrogenLifetechnologies产品)试剂说明书进行。采用紫外可见光分光光度计(英国UV-visibleSpectrometer,UV300)测定260nm、280nmOD值,并计算RNA的纯度及含量。样品-80℃保存备用。实时定量RT-PCR:(1)逆转录:应用cDNA合成试剂盒(宝生物工程大连有限公司)合成cDNA。取2μL总RNA作为imoban,oligo-dT做引物,反应体系为20μL,反应条件为37℃15min,85℃5s。(2)实时定量RT-PCR:α-MHC、β-MHC和内参照β-actin基因扩增的引物序列均由北京华大基因公司设计并合成(见表1)。(3)PCR反应体系为:SYBRPremixExTaq(2X)10μL,PCRForwardPrimer(10μM)0.4μL,PCRReversePrimer(10μM)0.4μL,ROXReferenceDyeII0.4μL,cDNA模板2μL,dH2O6.8μL,总反应体系为20μL。PCR循环条件为:95℃0.5min1个循环,95℃5s,60℃34s40个循环,95℃15s,60℃1min,95℃15s1个循环。PCR结束后,分析结果并计算,利用SDS7000软件分析实时PCR实验结果。尿碘值用尿碘中位数表示,其余数值用表示。两个样本均数比较用t检验,两个以上样本均数比较用方差分析。P<0.05为有统计学意义。全部数据均输入Excel工作表中,用SPSS17.0软件包做统计学处理。3心率和心肌供血量见表2。见表3。模型组大鼠与正常组比较心率减慢,QRS波峰值电压降低(P<0.01),心肌供血不足;治疗后两组均有所改善,两组之间比较无差异。见表4。3.4心脏指数模型对照组大鼠心脏指数明显高于正常对照组(P<0.01);其余各组之间差异无统计学意义。见表5。3.5细胞水肿显见图1~4。正常组大鼠心肌细胞肌丝排列整齐,横纹清晰,胞核明显,无细胞肿胀;模型组大鼠心肌细胞肿胀,部分胞浆溶解、消失,液化性坏死,胞浆染色淡且模糊,肌纤维断裂,间质水肿;治疗56天后芪贝复元饮组和L-T4组均有所改善,芪贝复元饮组尤为明显。3.6甲减质剂对心肌细胞-mhcmrna表达的影响溶解曲线分析显示,目的基因的曲线均成单一峰,峰型锐利,在曲线的其他位置未见到波形,说明扩增产物为特异性产物;扩增产物平滑完整、重复性良好。见图5。用2-ΔΔCT法来决定目的基因在各组的表达的相对水平。甲减时,心肌细胞α-MHCmRNA表达下调,受TH负向调节的β-MHCmRNA表达量呈显著上升。治疗后,α-MHCmRNA表达增加,β-MHCmRNA表达量减少,见表6,图6。4th对大鼠心肌-mhc基因表达的影响甲减心脏损害最早由Zondek于1918年首先报道。其定义为:甲状腺功能低减;除外其它原因引起的心脏扩大(心电图表现心动过缓、低电压、T波低平和/或倒置);甲状腺激素替代治疗后心脏病变好转或消失。如果病人有心包积液或心脏收缩时间间隔(STI)延长,则更有利于甲减性心脏病的诊断。肌球蛋白是影响心肌收缩的主要结构蛋白,由Kuhne于1859年首先报道。正常情况下,肌球蛋白存在于心肌细胞质内,是一个六聚体的蛋白质大分子,可分为2条重链(MHC)和4条轻链(MLC)。重链分为α型和β型2种,α链有很强的ATP酶活性,能使ATP转化为ADP,引起心肌收缩,而β链的转化能力较弱。在过去20年里,TH通过影响蛋白MHC基因家族的表达对横纹肌可塑的作用越来越明显。TH能够促进心肌α-MHC基因的表达,抑制β-MHC基因的表达,使编码α链的mRNA增多,ATP转化为ADP的能力增强,从而提高心肌的收缩力。甲减时,TH分泌减少,心肌细胞α-MHCmRNA表达下调,受TH负向调节的β-MHCmRNA表达量呈显著上升。刘桂芝等的实验证明大鼠长期碘缺乏,出现较严重的甲减,心肌细胞中受TH调节的靶基因α-MHCmRNA表达下调,而β-MHCmRNA表达明显上调,导致心肌收缩力显著减弱而影响心脏的功能。心脏是受甲状腺激素(TH)调节的重要靶器官之一,甲状腺激素首先与心肌甲状腺激素受体(thyroidhormonereceptor,TR)结合,活化的受体再与甲状腺激素调控基因上的甲状腺激素反应元件(thyroidhormoneresponseelement,TRE)结合,TRE通常位于靶基因转录起始部的上游,从而启动甲状腺激素调控基因转录,TR是甲状腺激素发挥作用的重要桥梁。所以说TH的生物学作用主要是T3与结合到DNA基因调节部位的T3受体(T3R)及其与相关蛋白的相互作用,通过调控靶基因的转录和表达而实现的。本实验大鼠饲养8周后,血清TH水平较正常组明显下降(P<0.01),出现了较严重的甲减,心脏指数明显增大。治疗后,芪贝复元饮组和L-T4组在TT3、TT4的恢复上无明显差异,但在THS的恢复和心肌细胞形态恢复上明显优于L-T4组;α-MHC的表达上芪贝复元饮组上升明显;β-MHC的mRNA的表达芪贝复元饮组下调明显。说明中药对甲减心肌细胞损伤的修复与直接补充L-T4并非完全一致,且优于单纯补充L-T4,这可能与中药对大鼠心肌α-MHC