kcpq2基因多态性与良性家族性婴儿惊厥的关联研究

kcpq2基因多态性与良性家族性婴儿惊厥的关联研究

良性家族性婴儿痉挛（bfic）是一种在孟德尔的模式下通过孟德尔遗传的癫痫综合征。其临床特点是儿童时期第一次不发烧，攻击形式多种多样，通常以某些攻击形式。2至5岁可自然消失，一般思维运动发育正常。一般攻击间脑电图（eeg）正常，遗传类型为常染色体显性遗传。BFIC具有显著的遗传异质性,国外目前已发现了3个BFIC疾病基因位点,分别位于染色体19q12.0-13.1、16p12-q12和2q24区域,国内几个BFIC家系的连锁分析虽然采用与国外相同的微卫星标记,结果则有很大差异,说明中国人BFIC家系的基因位点可能与国外有所不同。已有研究发现,另一种生后早期癫综合征-良性家族性新生儿惊厥(benignfamilialneonatalconvulsions,BFNC)与钾离子通道基因KCNQ2和KCNQ3突变有关。国内王家勤等对1个BFIC大家系进行基因定位,发现与KCNQ2基因所处的染色体区域20q13.3连锁。2005年7—12月,我们对1个BFIC大家系进行KCNQ2基因测序分析,发现了一种新的错义突变G812T,突变导致KCNQ2蛋白成孔区P环处的一个甘氨酸被缬氨酸代替(G271V),此处的甘氨酸在KCNQ家族高度保守,现报告如下。对象和方法一、家系患儿中苯巴比妥钠必要性检测1个BFIC大家系,4代62人,其中患儿17人(图1)。先证者Ⅲ32,在生后65d无明显原因出现频繁的无热惊厥,表现为发作性凝视或双眼上翻,口周发绀,口吐白沫,四肢强直或阵挛,双手握拳,无小便失禁。每次发作持续20s～10min,每天发作10余次,发作间期吃奶可,哭声、反应可。行血常规、血生化、头颅CT检查未见异常。给予补液、补钙、脱水降颅压、安定静注等治疗,仍有抽搐发作。后给予苯巴比妥钠负荷量20mg/kg,分2次肌肉注射,12h后给苯巴比妥钠维持量3～5mg/(kg·d),患儿未再抽搐。随后家长因经济困难出院,出院后口服苯巴比妥钠10mg,每日2次。随访2个月,患儿精神运动发育正常,停苯巴比妥后,惊厥复发2次,表现同前。家系其余患儿的发病年龄均在半岁以前,其中2～3个月发病者有7人,4～6个月发病者有10人。患儿在起病初期惊厥发作频繁,但发作间期正常,无惊厥持续状态。除先证者外均未接受抗癫治疗,15名患儿发作在1岁前消失,仅2名患儿发作持续至婴儿期后,在情绪刺激等诱因下仍有发作。发作类型以全身强直-阵挛发作为主,1例(Ⅱ11)伴热性惊厥,1例(Ⅲ21)伴舞蹈样手足徐动。家系中除1人(Ⅲ21)智力低下、生活不能自理,1人有轻度学习困难外,其余成员精神运动发育及智力正常。二、方法1.dna的提取抽取家系成员及无惊厥病史的75名健康对照每人外周血5～10ml(EDTA抗凝),采用Gentra公司提供的基因组纯化试剂盒抽提DNA,1×TE溶解,-20℃保存。2.引用材料设计3.dns扩展4.pcr和测序方法PCR产物用promega公司提供的WizardTMPCR产物纯化试剂盒纯化。以PCR反应的引物为测序引物,用PE公司提供的Bigdye末端标记测序反应试剂盒,用4色荧光标记4种脱氧核苷酸,按Sanger双脱氧终止法进行双向测序反应。PCR反应条件:96℃变性10s,55℃退火5s,60℃延伸4min,计30个循环。反应产物用70%乙醇沉淀,95℃变性5min后,在美国PE公司的ABI377测序仪上进行测序,上机电泳。采用PolyPhred软件对测序结果进行分析,综合正反向测序结果识别突变位点。采用PCR-单链构象多态性(SSCP)分析进行基因型和表型的共分离研究及排除多态性。bfic的遗传多样性研究遗传因素在小儿癫的病因中起重要作用,约有70%的小儿癫属于独立的遗传性疾病,称为特发性癫。BFIC就是一类新近认识的少见的常染色体显性遗传的特发性癫。最早在1963年,Fukuyama报道了一个日本家系,1992年Vigevano报道了5个意大利家系,并首次提出了该疾病的诊断标准。此后,在法国、新加坡、瑞典、美国、德国、澳大利亚、英国等地也有该疾病的报道。2001年Engle在国际抗癫联盟提出的癫综合征方案中新定义了这一疾病。其临床特点为首发于3个月～1岁的短期内反复出现的无热惊厥,发作形式多样,以部分性发作多见,有婴儿惊厥家族史,患儿中女性更多见,无其他引起惊厥的原因,发病前后精神运动发育正常,长期预后良好。本家系的临床特征符合BFIC。回顾文献报道的BFIC家系的临床资料和发作类型,BFIC具有多种表型,发作形式多样。1992年Vigevano等报道的5个意大利家系,患儿惊厥发作主要为部分性发作。Berkovic等报道的澳大利亚家系,13例患儿中有4例有热性惊厥病史,3例携带者无临床发作史,证实了BFIC的不完全外显率。Szepetowski等所研究的家系,患儿的显著特征是伴有发作性舞蹈手足徐动症。1993年Lee等首次报道了黄种人群中11个来自新加坡的BFIC家系,主要发作类型为全身性强直-阵挛发作。再对照本研究的家系,提示华裔人种BFIC发作类型主要为全面性发作,以全身性强直或强直-阵挛发作常见,与意大利、法国等地BFIC家系主要以部分性发作为特征的表型不同。BFIC具有明显的遗传异质性,Guipponi等对5个意大利家系在选用40多个微卫星DNA标记进行连锁分析后,证实了此家系的BFIC疾病基因定位于染色体19q12.0-13.1,这是报道的第1个BFIC疾病基因位点。之后,Gennaro、向燕群、王家勤等的家系研究均排除了BFIC疾病基因与19q连锁的可能。Szeptowski等对4个来自法国的伴阵发性舞蹈手足徐动的BFIC家系进行连锁分析研究,将第2个BFIC疾病基因位点定位于16p12-q12。2001年Malacarne对8个意大利BFIC家系进行连锁分析,在假设存在遗传异质性的模式下,有4个家系在跨距0.7cm的D2S399和D2S2330之间获得最大多点LOD值为6.29,从而将第3个BFIC致病基因定位于染色体2q24,同时他们排除了另4个小家系与2q的连锁关系。至今已经克隆出多个与癫相关的致病基因,其中大部分是离子通道基因。目前已明确位于20q13.3的钾离子通道亚单位基因KCNQ2和位于8q24的与KCNQ2高度同源的KCNQ3基因突变是BFNC的分子发病基础。唐北沙等于2003年在国内首次进行了KCNQ2基因突变分析,发现了KCNQ2新突变1931delG。大约有15%的BFNC患儿在生长发育中还会出现惊厥,BFNC致病基因KCNQ2和KCNQ3也被称为癫易感基因,推测有KCNQ2或KCNQ3基因缺陷的患儿在内外因素的二次作用下,如:情绪紧张,轻度脑损伤,或其他癫易感基因的存在时,可发展为慢性癫。BFIC与BFNC均是生后早期起病的良性惊厥,两者在临床表现上有很多相似之处,在起病时间上也有重叠,BFNC家族中至少有1个患儿的发病年龄在生后第1周(BFNC诊断的重要标志之一),但也有部分患儿在出生后3～6个月发病,因此部分BFIC可能与BFNC有相似或相同的分子遗传学基础。国内王家勤等将一个BFIC大家系的疾病基因定位于KCNQ2基因所在的染色体区域20q13.3,我们在一个BFIC大家系中进行KCNQ2基因DNA直接测序,发现了一个新的错义突变G812T,基因型与家系中患儿的表型共分离,导致患儿的KCNQ2通道第271位甘氨酸被缬氨酸替换(G271V),被替换的甘氨酸位于KCNQ2蛋白成孔区的P环,是目前发现的第3个KCNQ2孔区突变(图3)。KCNQ2和KCNQ3蛋白属于电压门控性钾通道家族,所有成员的蛋白亚基结构都颇为相似,均含有6个疏水跨膜区(S1～S6),1个位于S5和S6区之间的保守的选择性离子孔区(P-Loop),1个位于S4区的电压感受器,以及在胞浆内的N末端和长的C末端。此家族已知有5种可以形成离子孔道的亚单位基因(KCNQ1～KCNQ5),KCNQ1突变是先天性QT间期延长综合征(longQTsyndrome,LQTS)的病因之一,KCNQ4突变会引起显性遗传性儿童性耳聋,KCNQ5由mRNA编码,可能对M型钾离子通道电流起调节作用。KCNQ2/KCNQ3共同表达形成异寡聚体M型钾离子通道,是一种慢激活、失活的电压门控性钾通道。KCNQ2和KCNQ3共同表达的电流比单一表达大10～50倍,KCNQ2或KCNQ3基因突变都可导致M电流减弱或消失,引起神经元兴奋性升高,导致癫症状的出现。大多数KCNQ2突变是缺失、插入或剪切位点突变,这些突变大多引起阅读框架的移位和提前出现的终止密码子,仅报道了少数几种错义突变,它们位于孔区或第4、5、6跨膜区。我们发现的G812T突变,使KCNQ2孔区的一个甘氨酸被缬氨酸取代(G271V),孔区这个位置的甘氨酸在许多动物的KCNQ家族高度保守(图4)。我们发现的G812T突变导致的氨基酸改变(G271V)与1998年Charlier报道的一个BFNC大家系中的KCNQ3突变的氨基酸改变(G310V)在同一位置,同样是孔区的一个甘氨酸被缬氨酸替换。Charlier在体外表达野生型KCNQ3、KCNQ3G812T与KCNQ2(按1:1:2的比例),结果发现,同野生型KCNQ3与野生型KCNQ2共表达(按1:1的比例)电流相比,电流幅度减少了20%～30%。研究认为,孔区的突变不影响KCNQ2在细胞膜上的有效表达,而是通过影响离子的电导使电流幅度减小,导致神经细胞兴奋性增高和爆发性放电。在LQTS患儿中也发现了KCNQ1此位置的甘氨酸被替换(G306R)。这些研究提示,KCNQ2基因G812T突变被替换的甘氨酸是一个具有重要功能,在KCNQ家族进化上高度保守的氨基酸,进一步开展G812T突变的功能研究,有助于我们深入理解原发性癫的分子发病机制。最早KCNQ2突变被认为与呈良性经过的BFNC有关,后来Dedek等在对抗癫药耐药的癫性脑病患儿及惊厥伴精神发育迟滞的患儿中发现了KCNQ2突变,我们的研究在一个BFIC大家系中发现了KCNQ2突变,基因型与表型共分离。这些说明,KCNQ2突变不仅存在于典型的BFNC家系中。KCNQ2钾通道开发剂Retigabin已进入二期临床实验,在新的特发性癫系谱中进行KCNQ2基因研究,进一步认识KCNQ2基因型与表型的关系,将为新型抗癫药的应用提供有效依据。志谢感谢所有家系成员和陕西省定边县人民医院的大力协助和支持以白细胞基因组DNA为模板,在