大鼠前庭神经传递的神经通路

大鼠前庭神经传递的神经通路

现在，异常的前庭感染信号是运动疾病（如恶心、呕吐和胃肠不适）的主要因素。脑干的最后区、孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)、迷走神经背核是运动病与化学药物等诱发恶心、呕吐的主要作用区域,称为迷走神经背侧复合体(dorsalvagalcomplex,DVC)。Takeda等认为前庭信号至DVC,特别是NTS,可能是通过间接投射完成的,而近年来的研究表明前庭核向NTS和迷走神经背核的直接投射可能在前庭-内脏调节中起重要作用,但尚未有形态学证据。本实验拟用束路追踪方法对前庭核向DVC的间接投射进行研究,以期为进一步探讨异常前庭传入引发恶心、呕吐的神经机制提供形态学资料。1材料和方法1.1神经/神经电泳健康成年雄性SD大鼠14只,体质量200～230g,由河北医科大学实验动物中心提供。分为前庭神经内侧核(medialvestibularnucleus,MVe)电泳泳入PHA-L及DVC电泳泳入FG实验组(7只),和前庭神经下核(inferiorvestibularnucleus,SpVe)电泳泳入PHA-L及DVC电泳泳人FG实验组(7只)。1.2小鼠脑室镜辅助电泳分离大鼠经称质量、戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉后,固定于脑立体定位仪上。切开顶部皮肤,用棉球擦去骨膜,用颅骨钻钻孔,暴露脑表面,按Paxinos大鼠脑定位图谱,在手术显微镜下向MVe(Bregma-11.80mm,中线旁开0.8mm,距脑表面7.4mm)或SpVe(Bregma-11.80mm,中线旁开1.5mm,距脑表面7.4mm)内插入吸有2.5%PHA-L(10mmol/L磷酸盐配置,pH8.0,Vector)的玻璃微电极(尖端外径约15μm)。PHA-L溶液通过银丝与电泳仪的正极相连,电泳仪的负极连于切开的皮肤上,通以6μA的正向间歇电流,通7s、断7s,持续15～20min。电泳完毕取出电极后,切开项部皮肤,分离肌肉,去掉部分枕骨,用棉球将小脑蚓部上推,暴露第Ⅳ脑室底。手术显微镜下认清位于菱形窝下端的最后区,于最后区较大处的中线右旁开约0.1mm,向DVC内垂直插入充有2.0%FG(生理盐水配置,Fluorochrome公司)的玻璃微电极(尖端外径约15μm),距脑表面深约0.2mm。FG溶液通过银丝与电泳仪的正极相连,切开的皮肤接电泳仪的负极,同样采用6μA的正向间歇电流,通7s、断7s,持续10min。电泳完毕取出电极后,缝合皮肤。动物存活1周,戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射深度麻醉、开胸、经升主动脉以100ml生理盐水冲洗血液,继而用4%多聚甲醛(0.1mol/L磷酸缓冲液配制,pH7.4)500ml灌流固定,共1.5h。取脑,在同样的固定液中后固定4～6h,移入含30%蔗糖的磷酸缓冲液(0.1mol/LPB,pH7.4,4℃冰箱)中至材料沉底。冰冻连续切片,片厚30μm,收集于PBS(pH7.4)中。选取一套进行裱片、干燥,于荧光显微镜下观察。1.3荧光显微镜观察选取FG注射区局限于DVC的脑干连续切片进行免疫荧光反应。步骤如下:(1)2%的正常山羊血清封闭过夜;(2)PHA-L抗体(Vector公司)1:500(含0.5%Triton-X-100,2%正常山羊血清),4℃孵育48h;(3)生物素结合的羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)1:200(含0.5%Triton-X-100,2%正常山羊血清),室温孵育4h;(4)Avidin-FITC(北京中山生物技术有限公司)1:200(含0.5%Triton-X-100),室温孵育2h。最后,裱片、自然干燥、荧光封片剂封片。于荧光显微镜下观察、照像。荧光免疫组化的阴性对照:用0.01mol/LPBS代替PHA-L抗体稀释液,按上述SP法进行免疫组化染色,结果为阴性。2结果2.1注射区2.1.1注射区局限注射区局限于MVe者3只(R3,R5,R6);注射区局限于SpVe者4只(R7,R9,R12,R13);注射区位于背侧巨细胞旁核、孤束核或未见任何标记者4只;在手术过程中死亡3只。2.1.2fg注射区注射区局限于DVC者6只(R1,R3,R6,R7,R11,R12);注射区中心位于尾段孤束核者1只(R5);舌下神经核者4只。2.2标记纤维与终末的关系将PHA-L电泳入SpVe(图1)后,在脑桥和延髓内顺行标记纤维与终末的分布有如下规律:(1)标记纤维和终末较多、为同侧优势的是前庭核群、舌下神经前置核、巨细胞网状核、背侧巨细胞旁核、下橄榄内侧副核C亚核和小细胞网状核;标记纤维和终末较少、也为同侧优势的是蓝斑核、尾段外侧臂旁核、KF核、A5区。孤束核内亦见少量的标记纤维,但终扣或曲张体极少见。(2)标记纤维和终末较多,分布为对侧优势的是延髓腹外侧区(ventrolateralmedulla,VLM)、外侧巨细胞旁核(Lateralparagigantocellularnucleus,LPGi)、尾段疑核、巨细胞网状核a部、巨细胞网状核腹侧部和三叉神经感觉核。在中缝大核及中缝苍白核内也有少量的标记纤维。将PHA-L电泳入MVe,顺行标记纤维和终末在脑桥、延髓的分布与泳入SpVe者基本相似,主要区别是在ILPGi和VLM内的标记纤维和终末较少。2.3逆标细胞同侧优势将FG注射于DCV(图2),逆行标记细胞主要分布如下:(1)逆标细胞密集、为同侧优势的是孤束核、LPGi、VLM、小细胞网状核、巨细胞网状核和KF核。(2)逆标细胞较稀疏、也为同侧优势的是尾段外侧臂旁核、蓝斑核、三叉神经脊核背内侧部、三叉神经感觉主核。(3)前庭核群内仅有零星分散的标记细胞。2.4纤维根标记与逆标准数据的重叠区域PHA-L顺行标记纤维核终末与FG逆行标记细胞的重叠区集中在VLM(图3,4)和LPGi(图5,6)。3自致ldvi本研究结果表明SpVe和MVe向VLM、LPGi、疑核、臂旁核、中缝大核和中缝苍白核等参与内脏活动调节的核团均有较多投射,而向NTS和迷走神经背核投射的纤维很少且缺乏终扣样结构,推测这些少量的投射可能是过路纤维。Takeda等认为前庭核到DVC的神经通路是前庭核→中脑腹侧被盖→海马→下丘脑结节乳头核→DVC。这一假设的间接通路并没有连续的、在光镜和电镜水平上进行研究的形态学证据。本研究将顺行追踪剂PHA-L注入SpVe或MVe,将逆行追踪剂FG注入DVC,发现只有在延髓的LPGi和VLM有顺行标记纤维与逆行标记细胞的重叠,提示这两个区域是最有可能中转前庭信号到DVC的部位。本室的研究还发现,用偏离垂直轴旋转刺激前庭,LP-Gi、VLM和NTS内均有大量的FOS阳性细胞,说明前庭信号确实能激活LPGi、VLM和NTS神经元。近年来的研究发现,LPGi和VLM还汇聚了迷走神经、蜗神经等多种感觉信号,并参与了躯体、心血管和呼吸等多种功能的调节。所以,LPGi和VLM是将躯体、内脏多种传入信号进行综合、分析,而后调节躯体和内脏运动的重要的信息整合中枢。形态学的研究证实,LPGi向小脑内侧核和下丘脑存在并行的投射,向蓝斑核也有大量的投射[],而异常的前庭信号对蓝斑核去甲肾上腺素能系统的抑制和对下丘脑组胺系统的兴奋可能是产生运动病的主要原因。所以LPGi和VLM,特别是LPGi可能在将前庭信号与其他感受器传入信号进行整合、调节躯体和内脏活动的同时,通过到DVC、蓝斑核、下丘脑等部位