荧光定量pcr检测轮状病毒肠炎患儿肠道中3种细菌

荧光定量pcr检测轮状病毒肠炎患儿肠道中3种细菌

采用荧光定量pcr法可以直接从样品中提取的细菌dna进行测定和定性分析。因16SrRNA具有在细胞中相对稳定,同时含有保守序列及高变序列等优点,近年来一直是微生物系统分类的一个重要指标,并且根据其设计属种特异PCR引物。该文用荧光定量PCR方法对肠道中较常见的3种细菌进行了定量,并与用传统的培养方法获得的结果比较,来证明荧光定量PCR法是一种特异、准确、快速、简便的检测肠道菌群的方法。1对象和方法1.1标准物质和样品的研究1.1.1药物及其生态制剂于2003年及2004年10月至次年1月在昆明医学院第一附属医院儿科住院的腹泻患儿,病前2周及病后收集大便标本前未用过抗生素及微生态制剂。用无菌离心管收集其粪便标本,在-70℃冰箱保存备用,用ELISA法进行RV-Ag的初筛,阳性标本进行RT-PCR和聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳明确为轮状病毒感染(在中国医学科学院生物研究所进行)。1.1.2elisa法检测选择同期到该院儿童保健科定时体检的正常儿童,其年龄、喂养方式与腹泻组相当,要求4周内无腹泻病或其他胃肠道疾病史,无抗生素及微生态制剂使用史,大便常规检查无异常,用ELISA法对其粪便进行RV-Ag检测为阴性者。以上述相同方法收集其粪便标本,于-70℃冰箱保存备用。1.2方法1.2.1悬浮细菌回复突变pbs所有粪便标本冻融后参照文献的方法,取大便1g加9ml的PBS(0.05mol/L,pH7.4)充分颠倒混匀5～10min,然后低速离心(1440r/min)5min,取上清,上述过程重复3次,收集上清高速离心(9200r/min)3min后取沉渣,沉淀的细菌用PBS液洗4次,水洗1次,后加50μl蒸溜水悬浮细菌及50μl1%TritonX-100破碎菌体,100℃煮沸5min立即放入冰水中冷却备用。1.2.2pcr索引1.2.3pcr扩增过程25μl反应体系包括10×Buffer2.5μl,4×dNTP(0.25mmol/L)2μl,MgCl2(25mmol/L)2.5μl,上下游引物(0.25μmol/L)各0.25μl,Taq酶(1u/μl)0.75μl,DNA模板3μl,水13.75μl。采用GeneAmpPCRsystem9600型PCR仪进行扩增。反应程序为:95℃变性5min后,95℃15s,55℃1min,72℃45s共30个循环,最后以72℃10min延伸后结束。扩增产物通过PAGE电泳显示各细菌的扩增片段。见图1。1.2.4荧光定量pcr检测细菌荧光信号25μl反应体系包括10×Buffer2.5μl,4×dNTP(0.25mmol/L)2μl,MgCl2(25mmol/L)2.5μl,上下游引物(0.25μmol/L)各0.25μl,Taq酶(1u/μl)0.75μl,DNA模板3μl,荧光染料SYBRgreen2.5μl,水11.25μl。采用GeneAmp5700型荧光定量PCR仪进行扩增与分析。在PCR的反应过程中,所形成的DNA会和荧光染料结合,两者结合后形成的荧光信号可被检测到。结合各细菌的溶解曲线,得到双歧杆菌引物二聚体的TM值为83～87℃,而产物的TM值为88～91℃(图2)。以此类推,大肠埃希菌的TM值分别为72.5～77℃和82～86℃,而乳酸杆菌的TM值分别为80～85℃及85～89℃。在定量过程中,需要将引物二聚体和荧光染料结合的荧光信号消除,所以在产物之前和引物二聚体之后的TM值之间加上5s以消除其引物,即经95℃变性5min后。各细菌的反应程序为:双歧杆菌95℃15s,60℃1min,72℃45s,87℃5s共40个循环,以72℃10min延伸后结束;大肠埃希菌95℃15s,60℃1min,72℃45s,82℃5s共40个循环,72℃10min结束;乳酸杆菌95℃15s,60℃1min,72℃45s,85℃5s共40个循环,72℃10min结束。利用相应的引物和模板进行荧光定量PCR反应,可得到不同拷贝的模板循环数与荧光强度关系图(图3),其中横坐标代表PCR反应的循环数,纵坐标代表DNA与SYBRGreen荧光染料结合后的荧光强度(Rn)。从图中可以看出不同拷贝数的模板随着循环数的增加,其荧光强度逐渐增强,当达到一定的循环数时曲线趋于平行,即出现“平台效应”。1.2.5荧光定量pcr方法的制备和测定dna分别纯化上述PCR反应过程中得到的双歧杆菌和大肠埃希菌PCR产物,具体步骤如下:在DNA溶液中加入1/10体积3mol/LpH5.2的乙酸钠,在旋涡混合器上稍加振荡或用手指轻弹离心管壁几次使之混匀,加入2～2.5倍体积的无水乙醇,振荡混匀并置于冰上30min,离心5min弃上清,加入1ml70%的乙醇,颠倒混匀离心弃上清,干燥沉淀。将干燥沉淀物溶于适当体积的无菌水或TE缓冲液即成。在分光光度仪上测定出2种纯化产物的A值。参照分子克隆,1个A双链DNA片段(1KB)相当于4.74×1013分子/ml,计算出每mlPCR产物中所含的拷贝数,然后做10倍系列稀释,使其形成109～105拷贝/ml,按上述条件进行荧光定量PCR。同时取准确定量的细菌(双歧杆菌由昆明加加宁生态食品有限公司惠赠,浓度为109CFU/ml。大肠埃希菌由昆明医学院附属第一医院保存的质控菌株培养,浓度为108CFU/ml。)做系列稀释后直接9200r/min离心3min,PBS洗2次,水洗1次,悬浮,破碎菌体,加热、即冷等步骤同前,所得细菌的DNA也同时进行荧光定量PCR,结果发现同一浓度的纯化的DNA和标准细菌DNA所出现荧光信号的初始循环数是一致的,证明了上述2种方法所获得的DNA都可以用来作标准曲线。乳酸杆菌的标准样品通过PCR产物进行纯化获得。将3种细菌的标准样品和待测样品同时进行PCR反应作为标准曲线,双歧杆菌的标准曲线见图4。以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标,以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标绘制而成。待测样品和标准曲线进行比较,获得各样品中3种细菌的数量。1.3统计分析所得结果经对数转换后以x¯±sx¯±s表示,两组间比较用t检验。1.4双歧杆菌的分子检测通过对标准的乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠埃希菌做引物交叉后行荧光定量PCR,用1%的琼脂糖凝胶电泳分析常规PCR扩增产物,以Mark为分子量标准,结果表明双歧杆菌在230bp处有特异性扩增区,而大肠埃希菌和乳酸杆菌无此特异性扩增区。乳酸杆菌在166bp处有特异性扩增区,而大肠埃希菌和双歧杆菌无此特异性扩增区。大肠埃菌也有自己的特异性扩增区,且引物特异性产物均有特征性曲线生长,而其它2种菌无特征性曲线。上述结果说明实验所设计引物能正确特异地鉴别3种常见的肠道菌群,为利用此引物定量测定3种细菌提供了依据。1.5荧光定量pcr检测通过对标准3种细菌做系列稀释(109～102个细菌)后行荧光定量PCR,少至100个细菌仍有特征性曲线生长,说明用此引物通过荧光定量PCR检测上述3种细菌有较好的敏感性。2不同性别罪犯肠道菌的数量30名健康儿童和52名腹泻儿童粪便的三类细菌的定量结果见表1,其中患儿与健康儿童进行比较,其肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量明显减少(P<0.05),而大肠埃希菌的数量差异无显著性(P>0.05)。所得结果与张琳等用培养方法获得的结果接近,见表2。3实时定量pcr方法的应用人体肠道菌群数量庞大,构成复杂。健康成人的肠道栖息着1014个细菌,是人体细胞总数的10～20倍,有多达近500余种细菌,其重量约1kg,每克大便的细菌的数量达到1012拷贝。肠道的微生物菌群与宿主的健康息息相关,它对宿主食物的消化、内源性和外源性物质的代谢、抵御致病菌的入侵等起着不可替代的作用。传统的细菌定量的方法是细菌培养后计数菌落,但是在复杂的肠道菌群中,只有一小部分(大约10%～40%)可以通过这种方法达到鉴定和定量。它只能定量检测可培养的细菌,不能检测许多无法培养和未知的细菌,而且它的敏感性很低、效率低、费时,费力,易受操作方法的影响,另外由于肠道菌群各种细菌的生长条件及生长率的不同,使培养鉴定法不够准确。随着分子生物学技术的发展,16SrDNA的基因序列分析,变性梯度凝胶电泳,温度梯度凝胶电泳,生物芯片技术,荧光原位杂交等方法已经广泛应用于人和动物肠道的菌群分析中。但是上述方法或者不直接或者需要和培养方法结合,并且具有技术要求高,费力及低敏感性等特点,在一定程度上都限制了它们的使用。只有实时定量PCR(real-timepolymerasechainreaction)法能够应用从标本中提取的细菌DNA来直接进行定量和定性分析。因16SrDNA具有在细胞中相对稳定,同时含有保守序列及高变序列等优点,近年来一直是微生物系统分类的一个重要指标,并且根据其设计属种特异PCR引物。荧光定量PCR(Fluorescentquantitative-PCR)是由美国于20世纪90年代末期推出的的一种新的核酸定量技术。它的工作原理为SYBRGreen是一种可以和双链DNA结合的荧光染料,在PCR反应过程中,随着PCR产物的增加,PCR产物与SYBRGreen结合的量也增大,两者结合后形成的荧光信号可被仪器检测到,通过对已知拷贝数的不同稀释倍数的阳性模板做荧光定量PCR,制出标准曲线,未知样品通过与标准曲线进行比较即可得出定量结果。实时定量PCR与常规检测细菌的方法相比,具有更省时省力,敏感性高,特异性强,操作简单快速的特点,且传统的方法只是可以检测活的病原体遗传物质,而这种方法不但可以检测活的细菌的遗传物质,还可以检测死的细菌的遗传物质,不受实验时间的限制。可以收集标本后冻存送到有该实验条件的地方检测,有利于各研究组织之间的合作。应用荧光定量PCR的方法对轮状病毒性肠炎患儿的肠道菌群主要是双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠埃希菌进行了定量分析,并和同年龄同性别的正常儿童菌群进行比较。其结果和其他文献报道的用培养的方法得到的结果接近,说明了荧光定量PCR法可以准确特异地对肠道菌群进行定量。PCR技术能快速特异地扩增目的基因,并能很容易的使得微微克水平的起始靶序列达到微克水平的量,PCR的敏感性推动了早期诊断技术的发展,但临床应用的最大缺点是假阳性污染,而杜绝产物污染带来假阳性的根本措施是在封闭状态下进行扩增和产物分析。荧光定量PCR可以使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行,并通过微机控制,实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果,该技术从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。在实验过程中,荧光定量PCR反应条件的选择和优化对于反应的成功与否非常关键,对于在反应过程中所需要的各种条件如引物、Mg2+的浓度、Taq酶、SYBRGreen及模板等物质的量和浓度都需要不断摸索,找出最佳的条件,尤其是各引物二聚体和产物的TM值需要反复的实验,才能在以后的PCR反应过程中消除引物二聚体