rp-hplc法测定青海产画法中2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-o-d-葡萄糖苷

rp-hplc法测定青海产画法中2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-o--d-葡萄糖苷

七宝美赞粒是2000年版《中国药典》收录的品种。它由七个香料组成：何首乌、当归、补骨脂（炒苦海）、枸杞（酒蒸发）、兔蚕丝籽（炒苦海）、椰子（炒）、椰子和牛膝（酒蒸发）。本品是在明代方士邵应节所传七宝美髯丹的基础上,经现代科学最新工艺提纯开发而成的具有滋补肝肾功能的纯天然药物,用于肝肾不足、须发早白、头眩耳鸣、腰酸背痛等症。现代研究表明:2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下简称为二苯乙烯苷)具有抗衰老、提高免疫、防止动脉硬化的功效,在体外对蛋白激酶C活性有一定的抑制作用。因此,该成分是七宝美髯颗粒中的活性成分之一。为了控制七宝美髯颗粒的质量,保证其疗效,笔者采用HPLC法测定了二苯乙烯苷在该制剂中的含量,并对测定方法学进行了研究。1仪器和试剂1.1高效色谱柱10成/ldp高效液相色谱仪(日本岛津CLASS-VP10AVP),C18—ODS色谱柱(4.6mm×250mm,25μm;大连依利特),HP1050/3D化学工作站。1.2样品七宝美髯颗粒,购于河南省医药公司,重庆某制药厂生产。1.3标准物质二苯乙烯苷对照品,批号0844-200003,供含量测定用(中国药品生物制品检定所提供)。1.4试剂所用试剂均为分析纯、色谱纯。水为重蒸馏水(自制)。2方法和结果2.1流动相2080用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水(20∶80)为流动相;流速1.0ml·min-1,检测波长320nm;理论板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于3000。2.2对照溶液的制备精密称取二苯乙烯苷对照品适量,加稀乙醇制成每1ml含35μg的溶液,即得。2.3稀乙醇法减失取本品细粉1g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入稀乙醇50ml,称定重量,加热回流30min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。制备方法的考察曾选用甲醇超声处理30min,稀乙醇超声处理30min,稀乙醇加热回流30min,甲醇加热回流30min,结果四种方法所得供试液色谱基本一致,10min内色谱峰已出完。以稀乙醇加热回流30min的供试液测定值最高,故确定以稀乙醇加热回流30min制备供试液。2.4标准曲线图的建立精密称取二苯乙烯苷对照品4.21mg(批号0844-200003,供含量测定用),至25ml量瓶中,加稀乙醇至刻度,摇匀,得0.1684mg/ml的对照品溶液。精密吸取5ml至25ml量瓶中,加稀乙醇至刻度,摇匀,得33.68μg/ml的对照品溶液。分别吸取5,10,15,20,25μl,按HPLC条件,进样分析。以进样量(X)对峰面积(Y)作图,得到其标准曲线图。其回归方程Y=2.94×10-7X+0.02748,r=0.99998,n=5。二苯乙烯苷对照品在在0.1684-0.842μg范围内,进样量与峰面积间呈良好的线性关系。2.5峰面积积分值准确吸取上述对照品溶液10.0μl,注入液相色谱仪,测定峰面积值,重复进样6次,二苯乙烯苷峰面积积分值分别为1121619,1142146,1147010,1147771,1156098,1148592,RSD=1.03%,n=6。结果表明,本法精密度较好。2.6峰面积值的测定取同一供试品溶液,分别于1,2,3,4,5,6h测定二苯乙烯苷的峰面积值,结果:RSD=0.78%,n=6。可知供试品溶液在6h内稳定。2.7rsd测定对同一批样品平行制备5份供试液,分别取10.0μl,注入液相色谱仪,进行含量测定,RSD=1.96%,n=5。表明本法重现性较好。2.8测定条件及干扰取缺制首乌的处方药材,按工艺制备制成缺制首乌的阴性制剂,照供试品溶液制备方法制成阴性溶液,分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液各10.0μl,注入液相色谱仪,按上述条件进行测定,记录色谱图,从色谱图中可以看出,方中其它成分在本测定条件下,对二苯乙烯苷的含量测定无干扰。见图1,图2,图3。2.9加样回收率试验分别取已知含量的样品5份,精密称定,分别加入二苯乙烯苷对照品溶液1ml(浓度0.97mg/ml),照供试品溶液的制备方法,分别吸取供试品液各10.0μl,按照上述色谱条件,测定二苯乙烯苷的含量,计算加样回收率,结果见表1。结果表明,本测定方法回收率良好。2.10试验中样品的含量分别取不同批号的样品,按本方法的测定条件,分别测定各样品中二苯乙烯苷的含量,测定结果见表2。3标准溶液的配制3.1二苯乙烯苷对照品的稀乙醇溶液不稳定,《中国药典》(2000年版一部)何首乌项下二苯乙烯苷的测定要求避光操作,实验中发现对照品溶液放置2d以后含量逐渐降低。因此,定量用二苯乙烯苷对照品溶液用前现配测定结果比较准确。3.2制何首乌是七宝美髯颗粒处方中的君药,二苯乙烯苷是制何首乌的主要活性成分之一,