中药微生物发酵技术的研究进展

中药微生物发酵技术的研究进展

液体发酵法是将营养物质溶解在液体中作为培养基，然后连接到细菌，并通过一段时间培养目标。液体发酵的优点是规模大,可以进行工业化连续生产,产量高,生产效率高,适于机械化和自动化生产,是当前微生物发酵工业的主要生产方式。实验室中的液体发酵可以使微生物迅速生长、繁殖,获得大量的培养物。液体发酵有静置培养和通气培养两种类型,静置培养适于厌氧菌发酵,如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等发酵;通气发酵适于好氧菌发酵,如抗生素、氨基酸、核苷酸等发酵。液体发酵受物质浓度、接种量、培养基成分、温度、pH、需氧量、发酵时间等条件制约。二战时期,由于成功创立了液态深层发酵技术,特别是通气搅拌液体发酵技术,使青霉素作为医治战伤感染的药物而迅速工业化生产,加之微生物代谢调控技术的应用和微生物发酵原料由过去单一性碳水化合物向非碳水化合物的变化,使发酵技术得以广泛地应用到工业、食品、药品等各个方面。液体发酵技术应用于中药研究开始于20世纪80年代,是将中药材与辅料拌和,置于一定温度和湿度下,通过微生物的发酵达到提高中药药效、改变药性、降低毒副作用、扩大用药品种等目的。国内外学者相继开展了利用微生物分解转化中药,特别依靠微生物对中药与中药药渣进行转化和再利用,对冬虫夏草、银杏、红豆杉等多种名贵中药进行了大规模的发酵实验,并对发酵后产物的化学成分及药理活性进行了较深入的研究,取得了有意义的研究成果。随着微生物研究的深入以及分离技术和结构鉴定的不断发展,研究发现真菌的液体发酵技术简易可行,通过对中药进行液体培养,除能够大量增殖菌丝或孢子,还可在发酵液中得到多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素等多种具有生理活性的物质,这些物质具有抗癌、抗炎、抗菌、抗溃疡和抗衰老等功效。我国药用真菌的液体发酵技术已接近世界先进水平,药用真菌的生产也由田间栽培发展到工业化发酵生产,这种方法周期短、规模大、效率高、质量稳定,且可直接从发酵液中分离提取活性成分。药用真菌的液体发酵技术已成为中药研发的一个重要方向,液体发酵技术在中药的研究与开发中主要有以下几方面的特点。1小碱的发酵转化中药中含有的化学活性成分有挥发油、生物碱、皂苷类、蒽醌类、萜类、黄酮类等,提高中药有效成分的含量,使中药能最大限度地发挥作用,是中药现代提取研究的一个重要方面。徐非一等采用微生物发酵法,从中药牛蒡子中筛选到一株具有转化牛蒡子苷能力的菌株HB-2,将其用于牛蒡子发酵时,利用其产生的β-葡萄糖苷酶将牛蒡子苷转化为牛蒡子苷元,将天然牛蒡子中含量甚微的有效成分牛蒡子苷元含量提高数十倍,提高了牛蒡子的利用率。欧志敏等采用黑曲霉发酵产生的β-葡萄糖苷酶酶液直接水解牛蒡子苷制备牛蒡子苷元,产率可以达到94.7%。甘草次酸是甘草中重要有效成分之一,但其含量较低。陈永强通过高产β-葡萄糖醛酸酶的菌种HC-12对甘草酸进行发酵转化,在优化的发酵和酶解条件下,使甘草酸在较短的时间内转化为甘草次酸和两分子13-D-葡萄糖醛酸,避免了酸水解法成分易破坏的不足,显著提高了中药甘草的有效成分含量。殷红等对产生小檗碱产量比出发菌株有明显提高的高产菌株S-NU-3-2的培养条件进行了优化,为开发利用发酵方法生产小檗碱的新途径奠定了基础。敢小双用真菌糙皮侧耳对中药党参进行液体发酵处理,发现党参皂苷、黄酮含量增加。王建玲等利用新月弯孢霉对重楼的发酵条件进行优化,发现重楼皂苷的转化得到了明显的提高,转化率达76.80%。田天丽从自然长菌的虎杖上分离鉴定了一株能转化两种苷类成分的根霉T-34,可高效、专一地将虎杖苷转化成更有效的成分白藜芦醇,将大黄素8-0-β-D-葡萄糖苷转化成大黄素,白藜芦醇和大黄素的提取率分别达到54%和80%。余志坚等研究发现用银杏水提取液对灵芝进行液体发酵,可促使其主要成分———三萜含量增加17.1%。Liulin等使用木霉菌液体发酵山药,研究出了由石油醚、乙醇和硫酸铵组成的三液相的最佳组合方式,最大限度地分离出山药中皂苷元(回收率达97.24%)和甾体皂苷(回收率几乎达100%)。张晓洁等首次从重楼组织中分离出若干株内生菌经过发酵产生重楼的主要成分———甾体皂苷,有望缓解重楼药用资源的紧缺。李姝诺等首次筛选出产黄酮类化合物的越橘内生真菌,检测出该菌株所产生的黄酮类化合物与越橘原植物产生的黄酮类化合物相同或相似,为将来利用工业发酵方法大量生产药用黄酮类物质提供了依据,对开发利用越橘资源有重要意义。2对活性成分的检测在液体发酵时,中药中的活性成分可能被微生物转化或修饰,产生新的物质,为研发新药提供了一条可能的途径。徐春等用地衣芽孢杆菌发酵红花黄色素A,高效液相检测发酵后生成了一种新的物质,对其分离、纯化,通过紫外光谱、红外光谱和质谱等方法确定了其结构式,同时药效学实验证明该新物质抗血栓作用强于红花黄色素A或纤溶酶。王曦等研究用乳酸菌发酵的黄芪发酵液抗疲劳实验中发现该发酵液能显著延长小鼠负重游泳时间,而相同剂量下黄芪不具有该作用。崔月花等发现薏苡仁对灵芝菌丝生长和灵芝发酵产物清除自由基有促进作用,并进行高效液相色谱分析,发现添加薏苡仁的灵芝发酵产物中出现了新的活性成分,具体是何物质有待验证。此外,LiuDerzen等对珍贵稀有的台湾牛樟芝分别进行野生体、固体和液体发酵,研究其对小胶质细胞的抗炎效果和防止神经退行性疾病的作用机制研究。3中药和生物活性化合物由于有些中药不仅可以为发酵物质提供营养成分,还能促进其活性物质的生产,所以不少学者通过中药材作为液体发酵培养基的成分,来增强药效和使其配伍产生协同作用。陈丽华等在黑木耳的液体培养基中通过添加中药来增强黑木耳的降脂作用,研究结果表明添加何首乌、银杏叶和决明子能提高黑木耳的降脂功效。李津等利用啤酒酵母提取出具有生物活性的GTF(葡萄糖耐量因子)。刘亚明等将GTF与中药葛根的有效物质葛根素共同发酵后,发现葛根素有稳定GTF活性和调控胰岛素受体基因的作用。张东升等以灵芝作为出发菌株,以中药葛根作为液体深层发酵基质时,发现葛根对灵芝菌丝体的生长具有促进作用,并对超氧阴离子的清除能力比灵芝效果好。崔月花等把7种中药作为基质发酵灵芝后,添加银杏叶、薏苡仁、生姜后灵芝清除羟自由基和超氧阴离子的效果都有提高,薏苡仁效果最好。陈俊荣等研究发现黄芪发酵粉(中药黄芪经液体深层发酵后低温干燥并进行破壁处理而制得的棕色粉末)对肿瘤化疗药物环磷酰胺有显著增效和减毒作用。贺晨雨发现黄芪粉有调节脂代谢、降低血糖的生物学效应。王锋等研制出苦瓜鸡腿蘑发酵液α-葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制率明显强于其他中药,且随着发酵液剂量加大降糖作用明显增强,优于未添加苦瓜组和阳性对照组。4液体发酵工艺菌科中药以固体栽培发酵为主,液体发酵技术可影响菌科生物量、多糖等。李羿等研究表明茯苓发酵罐液体补料发酵与摇瓶补料液体发酵相比,可提高茯苓的生物量,使菌丝干重从10.74g/L增长到11.95g/L;将薏苡仁添加到茯苓发酵罐液体发酵培养基中,可促进茯苓的生长;在最佳补料液体发酵工艺条件下,茯苓菌丝体产量达15.09g/L,茯苓胞外多糖产量达7.52g/L;将薏苡仁、黄芪、金银花、甘草等9味中药固体粉末添加到发酵基础培养基中,研究表明其对茯苓摇瓶液体发酵中菌丝体和胞外多糖产量有影响。吴红娟等发现加松根液发酵培养的茯苓菌丝产量提高,但水溶性多糖含量下降;发酵菌丝中水溶性多糖含量较天然茯苓显著提高。张帆等以菌丝体的生物量和多糖为指标,对中药大马勃的液体发酵培养基及培养条件进行优化筛选,确定了最佳液体培养基组成,为液体发酵生产大马勃的工业化生产提供了依据。刘媛等研究了10种具有消炎功效的中药对灵芝菌液体培养的影响,观察中药对灵芝菌生长和代谢产物灵芝酸的影响,发现发酵可明显改变灵芝生物量和胞外灵芝酸产量的作用。杨海龙等研究了薏苡仁为基质的灵芝液体发酵培养基的条件,薏苡仁油作为基质时,发现该成分能促进灵芝菌解体及胞外多糖的生产。毕澎洋等直接在培养基中加入不同浓度的薏苡仁油和薏苡仁酯,可促进灵芝菌体生长、灵芝多糖及灵芝酸的生产。朱强等以固定量的甘草、山茱萸、黄芪、黄芩4种中药作为培养基进行灵芝的液体发酵时,发现甘草和山茱萸对灵芝的生长有明显的促进作用,甘草利于促进灵芝酸,尤其是胞外灵芝酸的合成,山茱萸利于促进灵芝多糖,尤其是胞外灵芝多糖的合成。汪维云等以菌丝生物量为响应值的响应面方程,对灰树花液体发酵工艺进行了优化;应用径向基函数神经网络的方法,对菌丝生物量进行了拟合;采用正交试验方法,研究了醇析浓度、浸提次数、浸提温度等因子对多糖提取量的影响。周洪波等以菌丝体质量浓度(干重)和发酵液中甘露醇浓度为指标,研究了蛹虫草液体培养中物理影响和培养基的最优控制,还创新性地采用了pH分段控制发酵策略以利于虫草生长,菌丝体质量浓度为17.31g/L,甘露醇质量浓度达43.47g/L。5中药药渣的发酵中药废渣含有大量粗纤维、木质等难以分解的材料,还含有一些中药有效活性成分和粗蛋白、粗脂肪、矿物质等营养素,采用液体发酵技术可实现对中药废渣再利用,减少药渣对环境的污染,提高对中药的利用率。焦巧芳通过发酵黄芪药渣筛选出可以作为中药药渣微生物转化利用的功能菌———棘孢木霉,并检测了酶活性、黄芪甲苷的含量、纤维素含量、抑菌性等,得到了该菌的发酵培养基优化条件。王建芳等采用香菇作为出发菌种对鼻渊舒系列产品的中药废渣进行发酵转化,在最优发酵条件下产物中粗蛋白和多糖的含量分别达19.84%和33.37%,经过液体发酵鼻渊舒中药废渣粗蛋白和可溶性多糖含量明显提高,纤维素含量降低。中药废渣发酵物能促进小鼠体重增加,增加免疫器官的发育,提高免疫能力,可作为一种增强免疫作用的饲料添加剂。6味地黄汤中药生物制剂中药复方是中医临床用药的主要方式,是由饮片组成并与“证”相关的治疗系统,中药复方经液体发酵后能显著提高疗效,具有减毒增效的作用。赵越将一种含有丰富的营养成分和生物活性物质的古老菌体———光合细菌引入到六味地黄汤中进行发酵代谢,通过光合细菌的生物转化功能和自身营养价值的利用,制备出了六味地黄汤中药生物制剂,该制剂经微生物发酵处理,将大分子物质代谢为小分子活性物质,提高了生物利用度,吸收迅速、完全,并降低了服用量,在增强免疫、抗衰老和治疗肾阴虚等方面具有明显作用,优于传统的六味地黄汤。郭芳等研究了六味地黄发酵液的免疫调节作用、抗瘤和减毒作用,表明六味地黄发酵液在增强小鼠的细胞免疫和体液免疫功能上优于六味地黄煎剂,非特异性免疫功能与传统煎剂比较差异无统计学意义;六味地黄发酵液对小鼠肝癌H22肿瘤生长具有显著的抑制作用,而六味地黄煎剂无此作用,并能升高外周血白细胞,表明六味地黄发酵液可抗肿瘤,并能减低化疗所致造血系统毒性损伤。徐启华等对玉屏风散发酵液与玉屏风散煎剂的免疫作用做了对比研究,发现发酵液能增强小鼠免疫功能,效果好于传统煎剂。7乳酸发酵饮料有些中药为药食共有资源,液体发酵技术应用于这类资源,可制得集营养与保健功能于一体的新型食品。葛根为我国卫生部公布的药食共有资源,以葛根为原料,张丽杰等采用双酶法生产酒精度为6.4%vol,总黄酮量为28.66mg/mL的葛根功能保健酒。张雁等将葛根汁与鲜牛奶按3:7进行配比,经乳酸发酵后制备出一种具有葛根和酸奶双重营养保健作用的无糖葛根酸奶制品。三株口服液以黑大豆发芽后的水提取液为发酵药材,以人体胃肠道中的双歧杆菌、乳杆菌和肠球菌为发酵菌种,在发酵罐内经液体混合发酵而成,临证对便秘、脾虚证、浅表性胃炎及慢性非特异性结肠炎有良好治疗作用。综上所述,液体发酵技术在中药的研究