重组人溶菌酶的研究进展

重组人溶菌酶的研究进展

溶菌酶是一种糖苷水解酶，与n-3-氨基葡萄糖（nag）和n-4-丙烯酸糖苷键作用。它可以水解成一些细菌细胞中的一些糖苷。这也被称为c-1和4-n-3-萘甲酸酶。它广布于人体心、肝、脾、肺、肾等多种器官组织中,在人体内与其他激素或维生素以复合物形式存在。此酶由粒细胞与单核细胞持续合成与分泌,由于它对G+菌有较强的杀菌作用,因此是人体非特异性免疫中一种重要的体液免疫因子。溶菌酶具有各种不同的生理生化作用,包括非特异性防御感染免疫反应、凝血作用、间隙连接组织的修复、参与黏多糖的生物合成代谢及抗菌作用等。长期以来,溶菌酶主要由生物组织中提取,产量低,费用大,易带来生物污染。重组人溶菌酶(recombinanthumanlysozyme,rHLZ)是用生物工程方法生产的新型溶菌酶,纯度高,制备方便。现综述抗菌一类新药rHLZ的临床前评价的内容及结果,希望对国内此类药物的开发起到借鉴作用。1主要药理学的疗效研究1.1rllz在g-菌及耐药菌中的抗菌作用采用琼脂二倍稀释法测定rHLZ对1040株致病菌(包括耐药菌株)的最低抑菌浓度(MIC值)。体外抗菌试验结果表明:rHLZ体外对试验菌株具有抗菌活性,MIC范围为0.125～>4000μg·mL-1,对金葡球菌、表皮葡萄球菌活性强,尤其对甲氧西林耐药的金葡球菌(MRSA),甲氧西林耐药的表皮葡萄球菌(MRSE)及克拉霉素、罗红霉素等耐药菌有效。对表皮葡萄球菌的抗菌作用强于对金葡球菌的作用。rHLZ对G-菌中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、枸橼酸杆菌、沙雷菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌等的抗菌作用较弱,多数菌株的MIC值≥4000μg·mL-1。首先进行rHLZ对HeLa细胞的毒性测定,再进行在HeLa细胞培养内对冠状病毒04号的毒力测定。观察不同浓度rHLZ在HeLa细胞培养内对冠状病毒04号的预防作用。试验采用病毒细胞(CPE)法,计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)。再观察不同浓度的rHLZ在HeLa细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用。rHLZ的最大无毒浓度(TD。)为750μg·mL-1,半数中毒浓度(TD50)为1500μg·mL-1,冠状病毒04号的半数感染量(TCID50)为10-3。预防试验中,rHLZ的IC50为5.9μg·mL-1,MIC为11.7μg·mL-1,TI为64。在抑制冠状病毒试验中,rHLZIC50为23.4μg·mL-1,MIC为46.8μg·mL-1,TI为16。1.1.2小鼠外施巴豆油总黄酮的单次给药对小鼠耳廓水肿度的影响小鼠外皮中巴豆油诱导耳廓水肿度的单因素试验,见表1采用小鼠巴豆油致耳廓肿胀试验检测rHLZ的抗炎作用。小鼠经外涂rHLZ,每只120,60,30IU,对巴豆油诱发耳廓肿胀度明显减轻。说明rHLZ具有抗炎作用。1.1.3对大鼠的单次给药后是否具有镇痛作用以涂药前和涂药后0.5～4h测每只大鼠的疼痛反应(甩尾)时间,观察大鼠涂抹rHLZ后是否具有镇痛作用。结果表明,每只大鼠尾巴涂抹rHLZ30,60,120IU后3h内,其痛阈明显升高。1.1.4细菌体内感染测定rHLZ对小鼠细菌感染败血症的试验结果表明,rHLZ静脉注射对金葡球菌01193,金葡球菌MSSA022,金葡球菌MRSA028,表皮葡萄球菌MRSE0210,肺炎链球菌01182,肠球菌ATCC700802所致小鼠败血症的感染具有一定的体内疗效,其半数有效量(ED50)依次为41.47,>400,>400,8.42,4.63和150.2mg·kg-1。rHLZ静脉给药对MRSE0210和肺炎链球菌01182感染小鼠的体内疗效分别显著强于克拉霉素4和30倍以上。rHLZ与克拉霉素联用,分别可增强克拉霉素单用对金葡球菌MRSA-028,金葡球菌MRSA022,表皮葡萄球菌MRSE210,肺炎链球菌01181,肠球菌ATCC700802的体内疗效19.6,3.1,2.1,18.7和1.5倍。rHLZ对小鼠细菌性咽喉感染的试验结果表明,浓度为0.4,0.2,0.1,0.05,0.025mg·mL-1的rHLZ经喷雾给药(每次100μL,qid),对小鼠咽部感染化脓性链球菌01-18-1和金葡球菌MRSABAA-42均具有明显疗效,在给药d2,d3,d4和d5均明显地使咽部感染细菌数降低,与感染对照组比较有显著性差异(且疗效优于克拉霉素、罗红霉素给药组)。rHLZ与克拉霉素(1:1)联用对小鼠细菌性咽喉感染的疗效与单用克拉霉素比较有显著性差异。联用的最佳浓度为(1.5±0.1)mg·mL-1,在该浓度下,其疗效显著地强于其他各给药浓度组。2对小鼠一般状态及心功能的影响采用小鼠、猕猴为实验动物模型,观察了rHLZ对小鼠一般状态及行为活动、对小鼠自发活动、戊四唑诱发惊厥发生率、协调平衡作用、热板刺痛值及胃肠推进作用。观察了rHLZ对麻醉猕猴的心率、血压、呼吸、体温及心电图指标的影响。小鼠口腔给药剂量为5,10,20mg·kg-1。猕猴采用累积给药方法,口腔喷雾给药剂量为1,5mg·kg-1,累积剂量为6mg·kg-1。研究结果表明,rHLZ5,10,20mg·kg-1对小鼠一般状态及行为活动、中枢神经系统无明显的作用,无镇痛和催眠的作用。rHLZ10,20mg·kg-1对小鼠胃肠推进功能有一定的抑制作用。rHLZ1,5mmg·kg-1对猕猴心率、血压、呼吸频率和呼吸深度、心电图指标、体温无明显影响。因此可以认为rHLZ对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统无明显的影响。口腔内给大剂量的rHLZ可能对消化功能有一定的影响。3动物分组及添加量采用昆明种小鼠,用氧气雾化吸入rHLZ冻干粉剂,给药1次。结果雌性小鼠的MTD>307.7或1003.5mg·kg-1,雄性小鼠>275.2或923.1mg·kg-1。实验发现吸入rHLZ后无异常反应,所有两组动物均存活到给药后7d,在7d内动物的活动、进食、大便未见明显异常,体重与同性别对照组比较无显著性差异。4长期毒性试验4.1大鼠单次给药后安全指标及评价试验动物为Wistar大鼠,设低、中、高(1,5,25mg·kg-1·d-1)3个剂量组和溶剂对照组。给药途径为雾化吸入,bid,连续4周。观测指标有一般药物反应、尿液生化、外周血有形成分指标、凝血指标、血清生化指标、血清中大鼠抗rHLZ抗体、大体解剖、脏器重量及病理组织学检查。结果发现,给药后对照组及各给药组动物精神状态良好,活动自如,大便成形,动物进食量无明显变化,各组动物体重不断增加,对照组和各剂量之间体重增长无显著差异(P>0.05)。各组动物尿液检查未见异常。给药组动物外周血指标无异常变化。用药组与溶剂对照组之间凝血酶原时间、凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间无明显变化。在给药期和停药期,对照组和给药组动物血清总胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶、血清钙、血清磷、总蛋白、白蛋白、尿素氮和肌酐均在正常值范围内波动。各组动物大体解剖未见异常,给药组与对照组之间动物脏器重量和脏器系数无明显差异。给药4周和停药2周后,各剂量组与对照组相比均无与给药相关的病理组织学改变。试验结果表明,大鼠雾化吸入rHLZ1～25mg·kg-1·d-1,连续4周,无提示毒性反应的指标变化,故可以认为≤25mg·kg-1·d-1为rHLZ在大鼠的安全剂量。在本试验条件下未发现毒性靶器官。4.2动物症状及病理组织学检测试验动物为猕猴,设低、中、高(1,5,25mg·kg-1·d-1)3个剂量组和溶剂对照组。雾化吸入给药,bid,连续4周。观察指标包括一般药物反应、尿液生化、心电图、眼科检查、凝血指标、外周血有形成分各项指标、血清生化指标、血清中猴抗人溶菌酶抗体、大体解剖、脏器重量及病理组织学检查。结果发现,给药后对照组及各给药组动物精神状态良好,活动自如,大便成形,动物食欲无明显变化,对照组和各给药组之间体重增长无显著差异。给药组动物的呼吸和鼻腔外观等与溶剂对照组比较无明显差别。各组动物尿液检查未见异常。给药组动物外周血指标无异常变化。给药组与溶剂对照组之间凝血酶原时间、凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间无明显变化。在给药期和停药期,对照组和给药组动物血清总胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶、血清钙、血清磷、总蛋白、白蛋白、尿素氮和肌酐均在正常值范围内波动。各组动物大体解剖未见异常,给药组与对照组之间动物脏器重量和脏器系数无明显差异。给药4周和停药2周后,各剂量组与对照组相比均无与给药相关的病理组织学改变。猕猴雾化吸入rHLZ1～25mg·kg-1·d-1,连续4周,无提示毒性反应的指标变化,故可以认为≤25mg·kg-1·d-1为rHLZ在猕猴的安全剂量。在本试验条件下未发现毒性靶器官。5物环磷酰胺应用效果选用昆明种种成年小白鼠,在妊娠后6～15d经雾化吸入rHLZ低、中、高剂量(2,10,50mg·kg-1)及阳性药物环磷酰胺8mg·kg-1(经灌服)。结果发现,雾化吸入受试药后,3个用药组的孕鼠增重、胎盘重量、每窝胎鼠数、胎鼠骨化、皮肤出血点和出血斑、胎鼠的体重、身长、尾长、尾骨数等各项指标与溶剂对照组比较无明显差异。阳性药环磷酰胺对母鼠有明显的毒性,对胎鼠有致畸胎作用。结果表明rHLZ50mg·kg-1以下剂量对妊孕母鼠和胎鼠未见毒性作用,亦未见致畸胎性。6血清中猴抗人溶菌酶抗体检测采用猕猴,试验设低、中、高(1,5,25mg·kg-1·d-1)3个剂量组和溶剂对照组。雾化吸入给药,bid,连续4周。观察指标为血清中猴抗人溶菌酶抗体。结果发现,给药后,未能检测到猴抗人溶菌酶抗体,表明rHLZ在猕猴无免疫原性。7病理组织学检查采用猕猴,试验设低、中、高(1,2,4mg·kg-1·d-1)3个剂量组和溶剂对照组共4个组。雾化吸入给药,bid,连续1周。观察指标包括一般药物反应、鼻腔、气管及肺的病理组织学检查。结果发现,给药后给药组和溶剂对照组动物精神状态、食欲、大小便和体温、体重等无异常变化。鼻腔和呼吸道等与试验前比较无明显变化。光镜下,溶剂对照组和用药组动物的气管及肺组织结构正常,细胞形态无异常,未见炎性细胞浸润和水肿、充血、增生等病理改变。结果表明,雾化吸入rHLZ1,2,4mg·kg-1·d-1,连续7d,无呼吸道刺激性反应。8动物药代动力学研究8.1单次注射d7:1,3.采用ELISA免疫药盒测定生物体液中rHLZ。给药途径为静脉注射以及雾化吸入给药。参照临床应用剂量按体表面积法折算为猕猴剂量。猕猴单次静脉注射0.8,2.0和5.0mg·kg-1rHLZ后1min实测血清抗原浓度达到最高,各组平均浓度峰值Cmax分别为(767±305),(4633±3535)与(15219±7531)ng·mL-1,高剂量组与中、低剂量组相比P<0.05。低、中、高剂量注射后末端相半衰期t1/2分别为(6.5±0.5),(7.5±0.8)与(7.2±1.5)h,各组间无统计意义差别。AUC0～∞分别为(510±219),(1117±359)和(3964±1809)ng·h·mL-1。低剂量组与中、高剂量组比较P<0.05,中剂量组与高剂量组比较P<0.05。剂量之比为1:2.5:6.25,AUC0～∞的增长为1:2.2:7.8,全身清除率CLs不随剂量增加而减慢。在注射剂量范围内表现为线性药动学。连续7d静脉注射2.0mg·kg-1rHLZ后的血清抗原浓度-时间变化、药动学参数和药物体内蓄积情况。结果表明,d7注射后各时间点的抗原浓度与首次注射后相同时间点浓度单侧配对t检验无显著差别。各药动学参数无统计学差别(P>0.05)。首次和第7次注射后注药间隔(i)的AUC0-24h分别为(1108±359)和(1397±428)ng·h·mL-1(P=0.2106);蓄积因子(第7次AUC/第1次AUC)为(1.41±0.72)(P=0.1891)。结果提示注射rHLZ2.0mg·kg-1·d-1,连续注射7d后未观察到具有统计学意义的抗原药物的蓄积升高。此外还研究了雾化吸入rHLZ后的全身吸收情况以及生物利用度。将rHLZ配成20mg·mL-1的溶液,按照250μL·kg-1(相当于5mg·kg-1)给动物雾化吸入后取血检测rHLZ水平。结果表明,给药后0.5,1,4,6,8h血清抗原浓度显著高于给药前水平,其他各时间点均在给药前水平波动。AUC0～24h计算值为(2.0±3.5)ng·h·mL-1。与相同剂量静脉注射给药相比,雾化吸入局部给药后相对生物利用度<1%,提示在上述给药剂量下雾化吸入局部给药全身吸收情况低,可以忽略不计。8.21u3000小鼠范围125I-rHLZ结合凝胶高效液相色谱(SHPLC)和三氯醋酸(TCA)沉淀法研究了125I-rHLZ在小鼠体内器官/组织中的浓度分布、代谢降解变化及其时间过程;总放射性在尿和粪中的排泄量和时间过程。在大鼠胆汁中的排泄量和时间过程,125I-rHLZ与血浆蛋白体外结合的情况。采用Iodogen法制备125I-rHLZ,SepgdexG-75分离纯化标记物。SHPLC鉴定125I-rHLZ的放射化学纯度为98.5%,放射性比活度为23.7kBq·μg-1,蛋白质浓度为0.5mg·mL-1,标记前后溶菌酶活力相近。方法学确证表明125I-rHLZ结合SHPLC和TCA沉淀法测定生物样品中125I-rHLZ的浓度满足分布试验要求。SHPLC测定表明小鼠静脉注射125I-rHLZ后在机体内迅速降解,静脉注射后5min放射性主要为保留体积与标准125I-rHLZ相同的原形药物,4h后放射性主要为保留体积增大的小分子125I标记物。表明总放射性变化不能反映原形药物浓度的变化。小鼠静脉注射20μg·kg-1的125I-rHLZ后10min,4,8和24h,用TCA沉淀法测定全身组织的放射性,结果显示AUC由高到低排列顺序为:肾、颌下腺、肠内粪、血清、膀胱、肠内容、胸腺、肝、肺、小肠、脾、肾上腺、淋巴结、胰腺、生殖腺、脂肪、眼球、心脏、肌肉和脑。泌尿排泄系统浓度最高,除颌下腺浓度高于血清外,其他组织均低于血清,脑中浓度最低,药物不易进入血脑屏障。小鼠静脉注射125I-rHLZ后放射性排泄较快,主要经尿排泄,少量经粪排泄。静脉注射后24h尿和粪中排出放射性分别为注入量的(74.4±7.0)%和(3.7±0.8)%,96h尿粪总排出率为(81.4±7.0