畜禽遗传材料收集与保存技术规程

畜禽遗传材料收集与保存技术规程范围本文件规定了XX省畜禽种质资源收集、整理与保存相关的术语和定义、样品来源、样品信息登记、采集人员要求、采集方法、包装与运输、安全管理、物流追踪和记录、样本信息管理。本文件适用于XX省畜禽种质资源收集、整理与保存。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB13690化学品分类和危险性公示通则GB19489实验室生物安全通用要求GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范GB∕T26938牛胚胎生产技术规程GB50140建筑灭火器配置设计规范NY/T1234牛冷冻精液生产技术规程NY/T1571羊胚胎移植技术规程NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NY/T3186羊冷冻精液生产技术规程NY/T3444牦牛冷冻精液生产技术规程AQ3013危险化学品从业单位安全标准化通用规范CNAS-CL05实验室生物安全认可准则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

畜禽种质资源livestockandpoultrygermplasmresources由中华人民共和国农业农村部发布，《国家畜禽遗传资源名录》收录的畜禽地方品种、培育品种、引入品种及配套系。畜禽种质资源基因库genebankofanimalgermplasmresources在固定区域建立的，有相应符合条件的相关专业技术人员、配套的设施设备等基础条件，以低温生物学方法为手段，保护畜禽种质资源的单位。生物安全biosafety国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人体健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。样品来源国家畜禽遗传资源目录所列畜种以及蜂、蚕。样品信息登记5.1根据附录A开展畜禽种质资源样本信息采集。5.2根据附录B开展畜禽种质资源样本编码。5.3根据附录C开展畜禽样本采集量和储存。采集人员要求样品采集人员须接受专业培训，熟悉品种特性，掌握遗传物质采集方法、储存条件及管理、防护措施等。采集方法精液采集保存牛冷冻精液采集和保存参照NY/T1234的规定执行；牦牛冷冻精液采集和保存参照NY/T3444的规定执行；绵羊和山羊冷冻精液采集和保存参照NY/T3186的规定执行；猪冷冻精液采集和保存参照附录D；其它畜禽精液采集和保存参照NY/T1900的规定执行。胚胎采集保存牛胚胎采集和保存方法参照GB∕T26938的规定执行；绵羊和山羊胚胎采集和保存方法参照NY/T1571的规定执行；其它家畜胚胎采集和保存方法参照NY/T1900的规定执行。卵子采集保存家畜卵子采集和保存方法参照NY/T1900的规定执行。细胞采集保存畜禽成纤维细胞的采集和保存方法参照NY/T1900的规定执行。组织样品采集保存活体采集将畜禽XX后，利用取样器采集组织，放入冻存管或灭菌的锡箔纸中，做好样本标记迅速放入-196℃液氮中保存。死亡动物样品采集动物死后2h内利用取样器采集组织，放入冻存管或灭菌的锡箔纸中，做好样本标记迅速放入-196℃液氮中保存。用于细胞培养的组织样本在取样后3min内用PH7.0的PBS溶液对组织样本进行冲洗、迅速放入细胞保存液中，4℃保存，以待后续细胞培养。血液样品采集保存将畜禽XX，对采血部位外进行局部消毒后，用采血针沿静脉缓慢刺入血管，待血液流出后收集在含有抗凝剂或无抗凝剂的采血管后4℃保存。需进行血浆和血清分离的样品，待全血运输到实验室后，须进行血清和血浆的分离，保存于-80℃冰箱。毛发样本采集保存畜禽XX后，对采集部位消毒后，分别采集背部、腹部、颈部、尾部的毛发（带毛囊）放入冻存管中，迅速放入-196℃液氮进行储存。包装与运输包装所有外包装上都应张贴标签及相应的包装规格标示，生物样本须选用三层容器：内层容器、第二层容器以及外层容器。盛装样本的内层容器须防水、防漏，并贴有标签注明样本类型、编号（采集编号和样本编号）、物种信息、日期、数量。内层容器外面要包裹足够量的吸收性材料，第二层容器也应防水防漏，用于包裹并保护内层容器。对于有温度运输要求的样本须选择合适的保温箱和冷冻剂等置于第二层容器和外层容器中间，包裹住第二层容器。8.1.5外层容器须坚固耐压。 运输样本的运输由畜禽种质资源基因库的工作人员承担，运输方式根据样本类型、运输距离及时间、温度要求等条件决定。运输前确认运输方式、目的地、运输证明文件等。运输文件须包括《样本信息采集单》。恒温（16℃~18℃）运输的样本，须使用车载恒温冰箱运输，恒温箱内应放毛巾隔热，以减少温度变化对样本的影响。低温（2℃~8℃）运输的样本，须使用装有冰袋的泡沫箱或其它一些制冷剂保持2℃~8℃运输；超低温（低于-30℃）条件运输的样本，用干冰保存运输；-196℃条件下保存的样本，须使用液氮罐进行运输，符合GB/T5458的要求。对于运输过程中可能出现的问题，工作人员须提前准备相关解决方案。物流追踪和记录运输开始前样本的发送方和接收方须进行沟通，保证接收方知晓样本可能到达的时间并做好接收准备。样本的发送方和接收方都须对样本的运输进行追踪。样本运输的信息如运输批号、样本量、规格、日期和运输负责人等都须进行详细的记录。装样运输时须核查是否达到各种样品运送需要的防震、恒温和防照射等要求，接样时核查样品是否符合要求。安全管理基本要求畜禽种质资源基因库须制定相应的保存计划和质量管理、出入库管理、安全管理、消毒防疫、重大突发事件应急预案等制度，以及遗传材料制作、保存和质量检测技术规程。有完整系统的技术档案资料。消防安全畜禽种质资源基因库防火系统须符合GB19489的规定。畜禽种质资源基因库灭火器的配置应符合GB50140的规定。生物安全畜禽种质资源基因库的样本采集和使用的过程中如涉及生物安全问题，在开展前须通过畜禽种质资源基因库的生物安全评审。化学安全畜禽种质资源基因库化学安全须符合GB13690的规定，在使用到有毒有害物质的工作区域，须符合AQ3013的规定。设备安全畜禽种质资源基因库的设施及仪器设备须建立安全维护系统，除制定有序的设备维护、更换计划，定期进行设施的维护和检查外，还须制定相关仪器设备检定、校准计划并组织实施。基因库相关设施设备的检修工作都须由专业技术人员来进行。环境安全畜禽种质资源基因库放置干冰、液氮的地方要确保空气流通，安装氧气与二氧化碳检测装置。液氮储存装置须通过监控装备自动或手动记录每天的液氮用量与剩余量。相关人员在操作干冰和液氮时，须做好防冻保护措施并佩戴专用的保护装备。样本信息管理畜禽种质资源基因库须有统一、完整的信息管理系统，满足样本追踪、检索以及与其他数据系统兼容或关联的需求，须根据不同工作人员职责设置相应的权限。畜禽种质资源基因库的信息管理系统须建立安全保障，防止黑客入侵、计算机病毒传播和数据损坏等意外情况，并须进行定期的维护、异地备份和历史备份。

（规范性）

畜禽种质资源样本信息采集单畜禽种质资源样本信息采集单畜禽种质资源样本信息采集单见表A.1。表A.1畜禽种质资源样本信息采集单采集编号样本类型血液组织细胞精液胚胎卵子毛发其他物种信息属种亚种性别繁殖方式采集地省/直辖市市县/区具体地点储存条件4℃-20℃-80℃液氮（-196℃）其他采集人员姓名单位日期

（规范性）

畜禽种质资源样本编码规则畜禽种质资源样本编码规则畜禽种质资源样本编码规则见表B.1。表B.1畜禽种质资源样本编码规则行政区域代码品种编号分管号性别类型猪：01001-NNNF-雌性D-DNA牛：02001-NNNM-雄性R-RNA羊：03001-NNNC-细胞禽：04001-NNNT-组织兔：05001-NNNB-血液蜂：06001-NNNE-卵子001-NNNEM-胚胎001-NNNS-精子001-NNNH-毛发示例：51010801001FB510108：XX省XX市成华区01：猪001：第一管样本F：雌性（Female）B：血液（Blood）51010801001FB即在XX省成华区采集雌性猪第一管血液样本

（规范性）

畜禽样本采集量和储存方案畜禽样本采集量和储存方案畜禽样本采集量和储存方案见表B.1。表C.1畜禽样本采集量和储存方案样本类型保存规格份/管数储存温度储存类型用途血液3-5mL3管-80℃全血/血清/血浆RNA/DNA/蛋白提取组织2-10g3管-80℃RNAlaterRNA提取3份-80℃普通组织RNA/DNA/蛋白提取3份-196℃OCT包埋RNA/DNA/蛋白提取3份4℃细胞保存液中储存建立细胞系胚胎单胎：1枚多胎：2枚200份-196℃冷冻保存动物扩繁、育种卵子单胎：1枚多胎：2枚200份-196℃冷冻保存动物扩繁、育种精液0.25mL猪：15000管牛：3000管羊：3000管-196℃精子动物授精、扩繁和育种毛发适量3管-80℃毛发核DNA和线粒体DNA分析

（规范性）

猪冷冻精液生产技术操作规程D.1采精前准备D.1.1种公猪D.1.1.1种公猪体型外貌和生产性能符合本品种标准，体质健康，系谱齐全。D.1.1.2采精前先修剪种公猪阴毛至2cm以下，刷拭公猪体表并清洗消毒。D.1.2采精室D.1.2.1检查假台猪是否平稳，擦拭假台猪后半部。D.1.2.2检查假台猪后方的防滑垫，防止公猪爬跨时打滑。D.1.2.3对采精室清洗，并用紫外线消毒。D.1.2.4采精室的温度须控制在15℃～25℃。D.2采精采精操作按照GB/T25172的规定进行。D.3鲜精品质检测D.3.1检测方法检测方法按GB/T25172的规定进行，并做好登记。D.3.2质量要求D.3.2.1外观淡乳白色或灰白色，均匀一致，无杂质。D.3.2.2气味略带腥味，无异味。D.3.2.3精子活力精子活力≥70%。D.3.2.4精子密度精子密度≥1×108个/mL。D.3.2.5精子畸形率精子畸形率≤15%。D.4鲜精处理D.4.1预稀释营养液（葡萄糖1.5g、乳糖3g、甘氨酸0.8g，蒸馏水100mL）先预热到32℃，与鲜精1：1混合均匀。预稀释后的精液放入17℃恒温箱内。D.4.2离心将预稀释精液装入100mL～500mL的离心管或离心杯内，在17℃和重力900g条件下离心15min后，弃上清液。D.4.3稀释冷冻稀释液（葡萄糖6.12g、EDTA0.3g、蒸馏水75mL、蛋黄20mL、甘油5mL、乙二醇0.83mL、青霉素和链霉素各1×105U）预热至17℃，以精子密度不低于4×108个/mL计算冷冻稀释液添加量。先取2/3冷冻稀释液加到离心管中，以吸吐方式混合均匀，装入专用器皿中，再用剩余冷冻稀释液冲洗离心管壁后合并。D.4.4平衡将盛放精液的器皿放入17℃水浴杯中，一同放进4℃冰箱，平衡1.5h。D.4.5分装D.4.5.1将精液分装到0.25mL或0.5mL细管中，标明生产场、品种、种公猪号和生产日期。D.4.5.2剔除有气泡、未灌满等不合格的细管精液。D.4.5.3将分装好的细管精液铺放在冷冻支架上。D.5冷冻D.5.1冷冻方式D.5.1.1程序冷冻：在程控冷冻仪的冷冻柜里，设置每分钟下降30℃的速度填充液氮。D.5.1.2熏蒸冷冻：将液氮倒入深度50cm以上的专用冷冻箱预冷10min，保持冷冻支架高于液氮面2cm、熏蒸冷冻8min。D.5.2包装将冷冻好的细管精液包装好，外包装上标明生产场、品种、种公猪号、生产日期和支数等。D.5.3保存将包装好的细管精液放置液氮中保存。D.6解冻解冻液（葡萄糖3.7g、无水柠檬酸钠0.6g、碳酸氢钠0.125g、EDTA0.125g、氯化钾0.075g，蒸馏水100mL。）预热至26℃。从液氮罐中快速取出2支～3支细管精液，放至38℃水浴锅中15s～20s或50℃水浴锅中7s解冻。剪开细管精液封口端，挤入数滴精液至1mL解冻液中，搅