人血清白蛋白的化学发光反应体系的研究

人血清白蛋白的化学发光反应体系的研究

1其他化学发光分析方法人类血清蛋白（hsa）的含量非常丰富。成人血液中大约有40克。该功能主要用于维持血液的正常穿透，并将亲水分子输送到血液中。临床上，作为一种血浆容量扩大剂，它被广泛应用于大出血、休克、烧伤、癌症、红白细胞增多、白细胞过少等疾病。人血清白蛋白的测定是生物化学和临床检验中的重要内容。测定人血清白蛋白的常规方法是光度法,但亦有荧光法及极谱法的报道。化学发光分析法(CL)以其灵敏度高、仪器设备简单、操作方便等特点,广泛应用于环境化学、临床检验、药物分析和工业分析等领域。流动注射-化学发光法(FI-CL)已广泛用于金属离子、氨基酸和药物分析,但用于蛋白质分析的报道却相当有限。黄春保等提出了反相流动注射-化学发光测定牛血清白蛋白、牛血红蛋白和人血清白蛋白的方法,并讨论了蛋白质标记物化学发光增强作用的原因;李永新等建立了一种灵敏度较高的测定蛋白质的猝灭化学发光方法,并应用于人血清样品中总蛋白的测定;Huang等将微孔分析盘技术和FI技术相结合,测定了标记链霉素的牛血清白蛋白;根据蛋白质-铜络合物的性质;Tong等开发了1,10-phenanthroline-H2O2-CTMAB-Cu2+体系,并用于鲁米诺化学发光检测BSA、HAS和γ-globulin等。作者在实验过程中发现,HAS可有效催化Luminol-K3Fe(CN)6反应,产生很强的发光信号,基于这一现象,本文建立了一种灵敏度高、准确度好的化学发光测定人血清中白蛋白的新方法。2实验部分2.1氨基酸的标准溶液自行组装的流动注射化学发光仪(FI-CL),包括:IFIS-C型智能流动注射进样器和CL流通池(西安瑞迈电子科技有限公司);R-212型光电倍增管(北京滨松公司);ND-802型直流前置放大器(南京大学微弱信号检测中心);色谱工作站(上海千谱有限公司);818型酸度计(美国,奥立龙公司)。人血清白蛋白(HSA),亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Gln)(美国,Sigma公司)。人血清白蛋白(HSA)和所有氨基酸标准溶液均为水溶液;鲁米诺储备液:2.0×10-2mol/L;铁氰化钾储备液:0.05mol/L;NaOH溶液:1.0mol/L;十六烷基三甲基溴化胺(CTMAB)溶液:1.0×10-2mol/L;十二烷基硫酸钠(SDS)溶液:5.0×10-2mol/L;KBr溶液:2.5mol/L;聚乙二醇辛基苯基醚(OP)溶液:2.0×10-2mol/L;β-环糊精(β-CD)溶液:2.0×10-2mol/L;三氯甲烷,乙醇;甲醇和乙腈是体积分数均为20%的水溶液。所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。2.2鲁米诺、铁氰化钾及载流、试样的流路分析于50mL容量瓶中依次加入1.0mL1.0×10-2mol/L的CTMAB溶液、一定体积的人血清白蛋白标准溶液,调节pH值,以二次蒸馏水定容,摇匀,然后经蠕动泵输入。分析流路见图1。鲁米诺、铁氰化钾溶液(A泵)及载流、试样(B泵)分别由两蠕动泵输入。在强碱性介质中,铁氰化钾氧化鲁米诺产生相对较弱的化学发光,当进样阀每次注入40μL的样品时,在体积为100μL的流通池内发生化学发光反应,光信号经放大,转为电信号后读出。3结果与讨论3.1人血清白蛋白对luminol-k3fe体系的催化作用图2为2.9×10-8mol/LHSA标准样品的化学发光曲线。结果表明:(1)人血清白蛋白对Luminol-K3Fe(CN)6体系有很强的催化效应;(2)该化学发光反应信号在几秒内迅速达到最大值,因此适合用于HSA的快速分析;(3)连续进样的化学发光信号稳定,表明该化学发光反应有良好的稳定性和重现性。3.2参数优化3.2.1流速和载流率分别改变A泵和B泵的流速,发现当鲁米诺、铁氰化钾的流速为4.0mL/min,载流和样品的流速为5.0mL/min时,信噪比最高、峰形好。3.2.2鲁米诺浓度对os/l范围内相对发光强度的影响实验结果表明:在5.0×10-6～5.0×10-5mol/L范围内时,相对发光强度随着鲁米诺浓度的增大而发生变化,当鲁米诺浓度超过3.0×10-5mol/L时,相对发光强度降低。选择鲁米诺的浓度为3.0×10-5mol/L。3.2.3铁氰化钾浓度对反应的影响考察了铁氰化钾浓度对该化学发光反应相对发光强度的影响。结果表明,相对发光强度在一定浓度范围内随铁氰化钾浓度的升高而增大,并且在铁氰化钾浓度增大到5.0×10-4mol/L时达到最大;但是,随着铁氰化钾浓度的继续增大,该反应的相对发光强度反而降低。因此,选择的铁氰化钾浓度为5.0×10-4mol/L。3.2.4影响系统ph值的影响改变铁氰化钾与鲁米诺溶液的pH值,并考察其对化学发光反应的影响,结果见图3。实验表明,当体系的pH=12.2时,发光强度达到最大值。3.2.5不同ph值对化学发光信号的影响pH值的选择样品的pH值在一定的范围内对化学发光反应有影响,在pH9.0～12.5范围内,化学发光信号随着HSA溶液的pH值升高而变化,当样品的pH达到12.2时,化学发光信号强度最大而后急剧下降。3.2.6ctmab协同催化作用据文献报道表明,某些表面活性剂及有机溶剂在一定程度上能对发光起到增敏作用。本实验分别考察了OP、SDS、CTMAB、EDTA、KBr和β-CD三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等物质对Luminol-K3Fe(CN)6-HSA发光反应的影响。实验结果表明:OP的加入将会使该反应的发光信号降低;KBr和β-CD能明显增强Luminol-K3Fe(CN)6发光信号,但对Luminol-K3Fe(CN)6-HSA反应无协同增强作用;SDS、三氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈等均未显示出明显的协同催化效果。如图4所示,CTMAB对该体系的发光具有明显协同催化作用,Luminol-K3Fe(CN)6-HSA体系的发光信号在一定浓度范围内随着试样中CTMAB的浓度增加而增大,而当试样中的CTMAB浓度为1.0×10-4mol/L时达到最大值。EDTA增敏效果不如CTMAB,故本文选择的增敏剂为CTMAB。3.3br-严重干扰在选定的实验条件下,考察了多种物质共存时对浓度为3.6×10-10mol/mLHSA发光强度的影响。试验结果表明:50倍的亮氨酸(Leu)无干扰;500倍的丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Gln)无干扰;1000倍的EDTA、甲醇、乙醇、SO2−442-、NO-3、F-,100倍的CHCl3、乙腈、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Mg2+不产生干扰。Br-严重干扰;1倍的Co2+、Ni2+,10倍的Cu2+、Pb2+、Cr6+等金属离子对HSA的发光强度有影响,加入100倍的EDTA后可消除干扰。3.4标准1:发光强度法在最佳条件下,HSA浓度在1.2×10-11～4.4×10-8mol/L范围内与发光强度呈良好的线性关系,回归方程为:y=4×1010x+371.01(R2=0.9942);检出限(S/N=3)为1.2×10-11mol/L;对2.9×10-8mol/L的标准样品平行12次测定,其相对标准偏差(RSD)为3.5%。3.5与传统分光光度法比较的回收率测定结果对比实验结果将离心后的人血液中的血清稀释1000倍,然后按实验方法进行分析,并将测定结果与常用的双缩脲分光光度法进行比较,同时进行