牛体外受精技术胚胎应用效果的比较研究

牛体外受精技术胚胎应用效果的比较研究

1982年，brackt等人首次报道了世界上第一个移动基因（ivf）牛，引起了生物科学家的高度兴趣。特别是牛外科技术的发展迅速，理论和方法也更加成熟和完善。它是动物胚胎工程的基础和重要研究分支，在20世纪80年代末开始开发。在中国,家畜繁殖技术,尤其是牛的胚胎体外生产技术发展很快,已初步具备产业化条件,发展前景广阔(王新武,2002)。牛扩繁产业化的技术分为体内胚生产和体外胚生产。体内胚生产即用常规的人工授精方法进行配种,而体外胚生产即体外授精技术。胚胎的体外生产技术包括超声监视下活体取卵(ovumpickup,OPU)、体外成熟、体外授精、体外培养及性别控制/性别鉴定等技术(张忠诚,2002),而性控胚技术的目的是获得大量优良遗传性状并已知性别的胚胎,用于胚胎移植,以快速获得良种牛群。OPU技术与IVF技术的有机结合不仅加快了优秀个体的繁殖速度,同时也解决了体外授精技术优秀卵母细胞的来源和胚胎系谱的问题(Pieterse等,1991),但是,IVF胚胎的质量是否与体内胚胎相当也一直饱受争议。作者对IVF胚胎与体内胚胎的移植妊娠率及出生后牛的性别比例、性控IVF与非性控IVF胚胎的囊胚发育率进行了比较,对性控IVF及非性控IVF的胚胎进行了性别鉴定,以期为性别控制胚胎扩繁技术产业化的推广应用提供参考。1材料和方法1.1试验材料1.1.1卵母细胞卵母细胞由上海交通大学医学遗传研究所松江实验基地提供。1.1.2西5.出/建筑节能型非性控精液购自上海奶牛育种中心,公牛号:30201,批号:20050312;性控精液购自大庆市田丰生物工程公司,公牛号:02129,批号:20050505。1.1.3资料与实验材料卵母细胞成熟液IVMD-101、受精液IVF-100均购自日本IFP;胚胎培养液ACM为上海医学遗传研究所克隆实验室配制(李晓晨等,2009)。其余试剂均购自美国Sigma公司。1.2测试方法1.2.1卵丘细胞的培养在超声仪监视下活体取卵,取出卵丘-卵母细胞复合体(COCs)放入成熟液(IVMD-101)中,5%CO2,38.5℃,饱和湿度下培养22～24h,将成熟的卵母细胞在受精液(IVF-101)中洗涤多次,去除多余的卵丘细胞,使卵母细胞周围保留2～3层的卵丘细胞。1.2.2受香精液处理非性控精液和性控精液均分别使用同一个体公牛的同一批号冻精。37℃水浴迅速解冻精液,将解冻后的精子置于3mL左右的受精液中,轻柔混匀后,2500r/min离心5min,弃去上清液,加入3mL受精液,轻柔混匀,以相同转速和时间再离心1次,弃去上清,用1mL左右受精液重悬沉淀。1.2.3精子与卵母细胞的培养调整精子终浓度在2×106～3×106/mL(性控精液精子终浓度控制为4×106～5×106/mL),精子与卵母细胞于5%CO2、38.5℃、饱和湿度下共培养6～7h。将受精卵放入上海医学遗传研究所克隆实验室自配的ACM培养液中于5%CO2、38.5℃、饱和湿度下培养。受精后48h统计卵裂率,第8天统计囊胚率。1.2.4麻醉后体移植将装有胚胎的移植管装入移植套管再装入移植枪内,移植套膜套在最外层,将受体母牛站立保定,用1mL麻醉剂“864”肌注及2mL利多卡因尾椎硬膜外麻醉,清除直肠粪便,消毒外阴后,将移植枪缓慢推至子宫角处进行胚胎移植。受体母牛移植60d后仍未返情,则通过直肠触诊诊断受孕情况。1.2.5胚胎的性别鉴定将冷冻管(装有1枚胚胎,培养液约10μL,)解冻,胚胎吹入洗涤小皿,在PBS液中洗3次,然后分别将1枚胚胎吸入1个PCR管中,立即加去离子水10μL、95℃加热裂解10min,之后用PCR扩增进行胚胎的性别鉴定。1.2.6sry基因核心序列根据牛基因组特异性DNA序列和Y染色体的性别决定区(SRY)核心序列设计PCR引物(表1)。内源对照特异性引物:采用引物YY1、YY2,反应体积25μL,包含DNA2.5μL(鉴定的1枚囊胚的裂解DNA于10μL水中)。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min。SRY基因核心序列特异引物:第一次扩增:引物C1、C2,反应体积25μL,包含DNA2.5μL。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,20个循环。第二次扩增:引物C2、C3,反应体积25μL(含第一次扩增产物10μL)。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环。取PCR产物15μL,用2%琼脂糖凝胶电泳检测,EB染色显影并拍照。1.2.7统计分析试验数据用SPSS13.0统计软件进行χ2检验,P<0.05为差异显著。2结果与分析2.1民法上的受体民法选择同步发情处理的母牛作为移植胚胎受体母牛,每头受体牛移植一枚IVF囊胚,共移植了30头受体母牛,同时用人工受精的69头受体母牛作为对照。移植60d后经直肠触诊诊断,结果显示,IVF组有12头受体母牛怀孕,妊娠率为40.0%;体内胚胎组有28头受体母牛怀孕,妊娠率为40.6%,两组妊娠率无显著性差异(P=0.957)(表2)。2.2工驼峰试验结果试验用Y染色体的性别决定区(SRY)核心序列进行PCR,对牧场普通人工受精及普通IVF的试验牛作了性别比例统计,结果显示,两者的公牛比例分别为51.7%与66.7%(P=0.041)(表3),存在显著性差异(P<0.05),即普通IVF出生的公牛比例明显高于常规人工受精。2.3普通iiif胚胎与性控不同性别比例通过PCR扩增的方法对普通IVF胚胎与性控IVF胚胎进行了性别鉴定,结果显示,普通IVF胚胎公牛比例(60.9%)显著高于性控IVF胚胎的公牛比例(11.5%)(P<0.0001)(表4)。2.4显著性差异检验普通精液IVF胚胎卵裂率为73.1%±3%,性控精液IVF卵裂率为57.7%±10%(P=0.001),存在显著性差异;然而普通精液IVF囊胚率与性控精液IVF囊胚率分别为40.4%±13%与36.6%±8%,无显著性差异(P=0.530)(表5)。3扩繁性别控制技术由于传统育种方式周期长、速度慢,无法满足国家经济发展及人民日益增长的物质需求,因此,体外受精性控胚扩繁技术能够加快优质奶牛群的建立,是迅速扩大良种畜群的有效手段之一。本研究比较了IVF胚胎与体内胚胎的妊娠率,结果显示,IVF胚胎移植妊娠率与体内胚胎妊娠率无显著性差异,证实IVF胚胎与体内胚胎的质量相当。另外,研究结果表明,IVF胚胎基本保持了正常胚胎的基因特性(Smith等,2009)。因此,应用良种牛IVF胚胎可提高牛肉、奶类的产量和品质,有着显著效果和重要的经济价值,而通过OPU技术取卵可大大降低生产成本,这是传统体内胚胎所无法比拟的,而且由于全部程序均在体外操作完成,这为IVF牛胚胎的大批量生产达到产业化规模提供了更广阔的发展空间。在胚胎产业化中,为了充分发挥母畜的繁殖潜力和公畜的生长优势,进而提高畜牧业的经济效益,排除畜群中有害基因和基因型,防止性连锁疾病,提高优良畜群的繁殖速度,研究者一直在进行控制家畜性别的研究(Underwood等,2010;Hochman等,1996;Palma等,2004)。目前对家畜性别的控制主要有两种方式,一是应用性控精液(Palma等,2008),二是进行早期胚胎的性别鉴定(曾溢滔等,1993)。本研究统计了牧场人工受精出生牛及普通IVF出生牛的性别比例,结果发现,常规普通精液人工受精出生牛及普通IVF出生牛的公牛比例分别为51.7%、66.7%,说明IVF的公牛明显高于理论值(50%);采用性控和非性控精液进行IVF试验,并应用PCR扩增牛SRY核心序列进行奶牛胚胎性别鉴定,说明普通IVF胚胎公牛的比例达60.9%,同样高于理论值(50%);而用性控精液进行IVF胚胎的公牛比例为11.5%,即性控IVF胚胎的公牛比例比普通IVF胚胎的公牛