黄厂中一种抗逆性发酵酵母的筛选与鉴定

黄厂中一种抗逆性发酵酵母的筛选与鉴定

黄酒是中国传统的烤酒，也是世界三大古酒之一。它具有独特的口感、丰富的营养成分和很高的保健效果，被称为“液体蛋糕”。它是以谷物为主要原料,利用酒药、麦曲或米曲中所含有的多种微生物的共同作用,发酵而成的酿造酒。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为关键微生物,对酒精发酵起主导作用。在黄酒的生产中,酵母细胞要经受各种环境因子胁迫,如温度、渗透压、pH、乙醇浓度等,当胁迫条件超过细胞的生理极限时,就会抑制细胞生长及酒精发酵效率。选育具备优良抗逆性能的黄酒酵母菌株,对黄酒发酵工业至关重要。目前,各种传统与现代分子方法被广泛应用于工业微生物的抗逆菌种选育,如原生质融合、基因组重排和定向进化等。从自然环境资源中分离菌株,测试菌株耐受性能强弱,筛选优良菌株,是工业微生物发酵,如葡萄酒、清酒和乙醇燃料等的重要选育方法。传统绍兴黄酒的发酵原料是酵母菌株的宝库,含有大量不同耐受性能的酵母菌株。黄酒酿造工艺是边糖化边发酵,起始发酵液中糖含量在20%以上,而主发酵时醪液中酒精含量12%~14%。高浓度醪液的渗透压力与产物乙醇积累造成的毒性,是影响酵母发酵效率的关键因素。本文采用高渗与高乙醇浓度两种胁迫条件来筛选酵母菌株,通过常规与分子生物学手段鉴定酵母菌的分类地位,在黄酒发酵条件下比较菌株的发酵性能及黄酒成分等。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1材料表面对照菌株(CK):安琪黄酒活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。1.1.2水硫酸镁孟加拉红培养基:葡萄糖10.0g,蛋白胨5.0g,磷酸二氢钾1.0g,无水硫酸镁0.5g,孟加拉红0.033g,氯霉素0.1g,琼脂20g,水1000mL。YPD培养基:葡萄糖2g,蛋白胨2g,酵母膏1g,琼脂2g,水100mL。其它碳源、氮源等生理生化鉴定用培养基根据参考文献的方法配制。1.1.3仪器、试剂盒立式压力蒸汽灭菌锅(YQX-LS-75SⅡ)与生化培养箱(SPX-250B-Z),购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;摇床(SKY-200B),购自上海苏坤实业有限公司;721可见分光光度计,购自上海菁华科技仪器有限公司;电子分析天平(AR2140),购自奥豪斯国际贸易有限公司;多功能微生物自动测量分析仪(ZY-300IV),购自北京先驱威锋技术开发公司;电脑三恒多用电泳仪(DYY-12),购自北京六一仪器厂;TProfessionalPCR仪(Biometra),购自北京东方安诺生化科技有限公司;电泳图像分析系统(FR-980),购自上海复日科技有限公司;光学显微镜(Olympus),购自杭州瑞泉医疗器械有限公司;酵母基因组提取试剂盒,上海宝生物工程有限公司产品;DL5000分子质量Marker为Takara公司产品。1.2测试方法1.2.1母字母组的分离与筛选1.2.1.悬浮液的稀释取粉碎好的麦曲和酒药各10g,发酵醪10mL,装入带玻璃珠90mL无菌水的三角瓶中,摇晃打散,使样品中的微生物形成悬浮液,将悬浮液稀释至106~107。1.2.1.菌株划分及分离样品经适当稀释后在YPD培养基上作涂布和划线分离,于28℃培养2~3d,选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌进一步划线分离纯化。然后将分离纯化后的酵母接到YPD培养基试管斜面上,于28℃培养2~3d,然后置于4℃冰箱中保存,以备酵母菌的筛选、鉴定等试验。1.2.2母菌的常规鉴定将菌株分别移接于YPD培养基中于28℃下培养2d后观察其细胞形态及菌落形态特征。酵母菌的生理学特征试验根据文献的方法进行。1.2.3培养条件:1将分离的菌株与市售的安琪活性干酵母进行生长曲线的测定,筛选到性能优良的酵母菌株。取斜面菌种1环至装有50mLYPD的250mL三角瓶中160r/min培养24h。将上述培养好的菌液调整OD600=1,然后按照10%的比例接入装有100mLYPD的500mL三角瓶中,每隔2h取出1mL菌液,4000r/min离心5min弃去上清液,加入9mL蒸馏水,使细胞重新悬浮,以蒸馏水为空白600nm下比浊,每个样品测定3次,取平均值,以培养时间为横坐标,OD值为纵坐标,绘制生长曲线。1.2.4一般鉴定1.2.4.整理剂和其它生物膜提取酵母基因组DNA用于PCR的DNA模板,基因组DNA的提取方法根据酵母基因组提取试剂盒说明手册进行。rDNA-ITS序列扩增以及测序所用的引物为ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系(100μL):Rnase-Free水44.0μL,2×TaqMasterMix50.0μL,上游引物(20μmol/L)2.0μL,下游引物(20μmol/L)2.0μL,模板DNA2.0μL。PCR反应程序:95℃预变性5min,95℃变性1min,51.7℃退火30s,30个循环,72℃延伸1min20s,72℃延伸10min。以DL5000DNA分子质量Marker为标准,1.0%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小,凝胶成像系统观察并记录结果。1.2.4.关于麻黄酵母菌的筛查PCR产物经纯化并测序,用得到rDNAITS片段DNA序列在Genbank核酸序列数据库中进行BLAST同源序列,查找与此序列相似的已知酵母菌。各菌株的同源序列经ClustalW软件进行序列匹配后,再用MEGA4.02软件构建Neighbour-joining进化树,模型参数选择p-distance,空位参数选择completedeletion,并进行1000次Bootstrap检验。1.2.5黄酒发酵试验1.2.5.后发酵主发酵在1000mL锥形瓶中加入200mL水、100g原料大米(换算成相应的熟米饭)、15g曲(原料大米的15%)、相应体积的活化酵母(使酵母数达到107左右),在28℃生化培养箱中培养5d进行主发酵,然后转入15℃生化培养箱中培养15d进行后发酵阶段。1.2.5.gc-ms色谱条件酒精度采用比重法;总糖采用斐林法;非糖固形物、总酸、氨态氮的测定参照国标法(上述指标均按照GB/T13662-2008《黄酒》中规定方法执行);酵母数采用血球计数板计数。黄酒中的高级醇采用气相色谱外标法测定,色谱条件为:GC-2014C气相色谱仪、氢火焰离子化检测器(FID);毛细管色谱柱:FFAP(30m×0.20mm×0.25μm);分流比:10∶1;色谱柱流量:1.3mL/min;线速度:37.4cm/s;总流量:17.3mL/min;进样器温度250℃;氢火焰温度250℃;H2流量:40.0mL/min;空气流量:400mL/min;载气(N2)流量:30mL/min;柱温程序升温:初始温度60℃,恒温1min后以5℃/min升温至120℃,恒温1min后以10℃/min升温至220℃,恒温7min。2结果与讨论2.1菌株抗逆性能力的筛选孟加拉红和氯霉素能够抑制细菌的生长,而对真菌无影响,因此被用于分离霉菌和酵母。本试验采用孟加拉红培养基分离样品中的酵母,从绍兴黄酒厂原料(包括酒药、发酵醪和麦曲)中总共分离到52株酵母菌。采用平板点样法,将分离到的52株酵母分别在含1mol/L、1.2mol/LNaCl和10%、12%乙醇的YPD琼脂培养基中培养,筛选对高渗浓度及乙醇环境胁迫有较高抗性的菌株(图1a),并进一步通过观察在同样环境胁迫条件下的YPD液体培养基中的细胞生长状况检验菌株的抗逆性能(图1b)。不同酵母菌株,尤其从酒药中分离到的28株酵母,对1mol/LNaCl和10%乙醇的耐受能力均表现出明显的差异。综合考虑菌株抗逆性能,最后筛选出对NaCl和乙醇均具有较强耐受能力的优良菌株F-18,用于后续的研究。在高渗透压胁迫条件下(图1b),菌株F-18与对照菌株的生长曲线趋势基本上一致,酵母数量差异并不显著,在10h时达到一个生长高峰,此时细胞代谢最为活跃,之后保持一个平稳增长的趋势。而在乙醇胁迫条件下,酵母菌株F-18在20h细胞数量达到最大值,而其生长速率明显高于对照菌株,表明其对乙醇的耐受能力强于对照菌株,而对照菌株的生长相对来说就受到了乙醇的抑制。2.2母菌的常规鉴定2.2.1培养菌株的细胞将筛选到的酵母菌株F-18分别接种于YPD液体和固体培养基中,28℃恒温培养1~2d,观察细胞形态和菌落形态。镜检观察菌株的细胞呈卵圆形或圆形,繁殖方式为芽殖(budding),没有假菌丝,细胞大小为3.6-6.2×4.9-10.6μm。在YPD琼脂培养基上,菌落颜色呈乳黄色,菌落形状为圆形,边缘整齐,表面平滑并有突起。在生孢培养基上28℃培养7d后有子囊孢子形成,每个子囊含1~4个子囊孢子,孢子呈卵圆形。2.2.2菌株f-18不同菌株的糖质鉴定酵母菌的生理生化指标很多,其中最为重要的是碳源和氮源的利用。酵母菌对碳源的利用有发酵和同化两种方式,表1是菌株F-18的糖发酵和碳源同化试验结果。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异,而且某一酵母菌能发酵某种糖,就能同化这种糖,所以同化糖类试验只需做那些不能被发酵的碳源。由表1可知,菌株F-18可以发酵或同化利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、棉籽糖和海藻糖等,但不能发酵或同化利用乳糖、L-阿拉伯糖、可溶性淀粉、纤维二糖、鼠李糖、柠檬酸、山梨醇和乙醇等。虽然一般酵母菌株能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和乙醇等作为碳源,但目前研究表明不同酵母菌的碳源利用能力也有比较大的差异。因此,通过菌株形态、碳源利用及其它生理生化试验结果(数据未显示),参考酵母菌株鉴定权威文献《酵母菌的特征与鉴定手册》,初步鉴定所分离到的菌株F-18属于酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。2.3pcr扩增和测序结果同基性序列的分析酵母菌在分类上的属、种位置可以由常规形态与生理生化试验确定,但如果想确定菌株属于哪个亚种,还需要采用分子生物学鉴定方法。随着分子生物学技术的发展,核糖体RNA基因(rD-NA)的内转录间隔区(ITS)已经被广泛应用于酵母菌亚种的分类与鉴定。因此,我们提取酵母菌的基因组,并使用引物ITS4/ITS5对酵母菌株F-18及对照菌株进行扩增(图3),所有菌株的PCR扩增产物的条带迁移均一,扩增出的片段大小大约为800bp,与ITS目标序列的长度一致。PCR产物回收并测序后,得到菌株F-18的rDNAITS片段序列。并用此序列BLAST搜索NCBI核酸数据库(/),获取与其同源的其它酵母菌株的ITS序列。通过多序列比对,并以邻接法构建rDNAITS的进化树(见图4)。结果表明,筛选到的菌株F-18与酿酒酵母种中各菌株的遗传距离较近,而与酵母属中其它酵母,如S.paradoxus的进化关系较远。因此我们以S.milkatae菌株为外群研究酵母菌株间的亲缘关系。由进化树可以看出菌株F-18与酿酒酵母菌Wu-Y2/X14-3的遗传距离最近(DNA序列只有一个碱基差异),可能属于酿酒酵母种的同一个菌株。而值得注意的是这两株菌株也是从中国其它地域分离:一株是分离至中国台湾米发酵厂(fermentedriceplant),一株是来自北京地区的鸽子粪便。因此,系统发育分析结果表明菌株F-18可能是野生酵母菌在黄酒发酵环境中发生适应性进化后的酵母菌株。2.4不同菌种对糖发酵的能力黄酒发酵过程中,发酵液中残糖的含量以及酒精度可以反应出酵母对糖的转化利用能力。本文选取菌株F-18和对照菌株进行黄酒发酵试验,结果如图5所示。在主发酵阶段,酵母对糖的利用率比后酵阶段高出很多,总糖的含量呈现明显的下降趋势,相对应地,酒精的含量则快速升高,表明此阶段酵母开始大量生长繁殖,发酵速度加快,通过EMP途径将糖转换为酒精和二氧化碳。到了后酵阶段,低温降低了酵母的生长繁殖,各种代谢活动也受到了限制,利用糖发酵的能力下降,发酵液中总糖以及酒精含量基本上维持在一个相对稳定的范围之内,变化幅度很小。F-18发酵结束后总糖的含量为5g/L,对照菌株的为3.8g/L,而两者的酒精度基本上相同,同时最终的酵母浓度也高于对照菌株,表明在产生同等的酒精度的情况下,F-18消耗的葡萄糖比对照菌株少,进而说明F-18对葡萄糖的转化利用能力高于对照菌株。GB/T13662-2008《黄酒》中对各种类型黄酒总酸的要求在2.5~8.0g/L之间,由表2可知,两者产生的总酸均符合国标,F-18总酸的含量比对照菌略高,酸含量适中,对黄酒的色、香、味有积极的促进作用;氨态氮的含量对黄酒的品质也有着重要的影响,酵母能将氨基酸进一步代谢生成重要的风味物质-高级醇,此外与糖发生美拉德反应,增加黄酒的色泽,菌株F-18氨态氮的含量也高于对照菌株。高级醇是黄酒重要风味成分之一,黄酒中含适量的高级醇可赋予酒体特殊香味;若黄酒中不含或少含高级醇,会使酒味淡薄,酒体不丰满;而且,随着黄酒贮存时间的增加,小部分高级醇被缓慢氧化缩合为酯,使黄酒具有特殊的“陈香”。但是高级醇含量过高时,对人体有毒害作用,并且随着分子质量的增加毒性相应的增加,因此必须控制高级醇的含量,