鸡白血病病毒亚型的诊断与鉴别

鸡白血病病毒亚型的诊断与鉴别

鸟血液是由鸟血液病毒（alv）引起的一种传染性肿瘤。这种疾病最初发现于中国的一些鸡病中。近年来，它也在鸡身上报告，并呈现上升趋势和衰落趋势。感染鸡产生发育迟缓,免疫抑制,生产性能下降,多组织肿瘤甚至死亡等,造成较为严重的损失。该病病原禽白血病病毒在鸡群中具有A/B/C/D/E/J等多种亚型,除E亚型少数几种内源性病毒外,其他亚型为外源性病毒,尽管一些报道指出内源性ALV致病性较弱或不致病,但可干扰对外源性的ALV流行病学调查和诊断,给外源性ALV净化防制增加了难度。我国一些学者一直关注该病在我国的发生、流行,并不断探讨相关诊断和防制方法,积累了一些宝贵经验,本文通过对我国近10年有关鸡白血病报道进行了统计和比较分析,并对其发展趋势进行了预测,希望为鸡白血病的防制提供一些素材。1鸡白领在我国不同地区的传播情况从1999年至2009年近10年的时间,我国鸡白血病的病例正式报道的有近70篇[9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20],除我国的少数几个省份没有出现报道外,其余各省均有鸡白血病发生的病例报道,占全国近80%的省份,这些报道在各省份的详细分布见表1。当然,一些省份虽然没有报道,但不一定没有病例出现;可以肯定的是已公开报道的,这些省份肯定有鸡白血病的发生。在这些报道的病例中,有的省份最多可达17例(占全国已报道的27.4%),少则1例(占1.6%),其中山东、北京、河北、广东等省份报道的病例较多,占全国病例数的50%以上。说明鸡白血病在这近10年的时间,几乎蔓延到我国所有省份地区,而且愈是养殖量大的省份,发生该病的机率愈高。显然,该病对我国的养鸡业发展造成严重的威胁。对鸡白血病病例报道的时间来看(表2),1999年仅有2例报道,随后逐年上升,在2003年和2009年分别出现病例报道高峰,分别达到9例和10例,占10年间报道的14.5%和16.1%。从2003-2009年,该病报道一直较多。这一方面与国内学者对此病的关注程度增加有关,更为重要的是该病对养鸡业的影响愈来愈大。表3列出鸡白血病鸡群对应的类型和品系,分析可看出,1999-2003年该病引起肉鸡发病的病例较多,特别是进口肉种鸡和商品肉鸡,而在蛋鸡上发病的报道较少;2003年至今,该病引起蛋鸡发病的病例增多,蛋鸡中以进口海兰鸡居多,另外还有尼克、罗曼,2008-2009年在海兰等进口蛋鸡上呈现暴发,给我国蛋鸡养殖业造成严重的经济损失和冲击;更为值得关注的是在我国一些地方品系鸡也出现ALV感染,到2009年在我国地方品系鸡群中报道ALV感染的有20多种,其中一些优良品种像黄鸡、麻鸡在很多省份都出现感染的病例报道,表明ALV在对我国地方品种已造成严重威胁。对感染ALV的鸡群比较还发现,进口的肉鸡和蛋鸡占70%以上,而地方品系占不到30%,且时间上是近几年才出现的病例,由此可推断ALV可能最初来源国外的进口鸡,而后通过一些途径传到我国地方品系中的。2alv的来源从ALV的病原来分析(表4),近10年所报道的分离ALV毒株大部分是J亚群ALV[2,5,9,10,11,13,15,18,20,21],少部分是A/B亚型ALV,而分离的J亚型ALV主要来自肉鸡;我国不同省份分离到的肉鸡J亚型ALV都含有较高的同源性,同时与国外报道的J亚型也有很高的同源性,这从分子进化角度证明了我国J亚群的ALV的来源是源自国外的进口肉鸡。而近几年从蛋鸡分离的几株J亚型ALV与肉鸡上的有很大的差异性且不同地区也有一定差异,表明蛋鸡中ALV可能来源不同。在我国地方鸡群中分离到的J亚型ALV与肉鸡上分离到的有较高的同源性,而与蛋鸡分离的ALV差别较大,表明我国地方鸡群中的ALV主要来源于进口肉鸡。值得注意的是近2年从一些种鸡和商品鸡中分离到多株A/B亚型ALV,说明在国外临床上早已鲜有报道的AB亚型ALV近几年在我国又有一定的上升趋势,在今后AL的鉴别诊断和防制中应值得格外关注。3临床现状及耐药机制从我们多年的研究积累和一些报道结果来看,ALV是一种不同于其他反转录RNA病毒,该病毒在宿主内具有间歇增殖排毒的特性,且与宿主间的免疫反应呈现多样性。表5中明确ALV与宿主间几种免疫反应关系。早期研究指出,一些鸡白血病病毒在感染鸡体内的排毒有间歇性,这种间歇性几乎没有规律可循,这给感染鸡群的早期诊断带来很大困难。国内一些学者对J亚型鸡白血病病毒产生抗体的规律进行过多次研究,指出一些感染鸡群能够产生抗体,并能产生抗体高峰,但奇怪的是鸡体内病毒滴度却很高,且持续时间也较长;更有一些鸡只出现免疫耐受,呈现病毒持续阳性而不产生抗体,这些鸡只一般感染后期出现肿瘤病理性变化和死亡等。鉴于这些,开发疫苗进行临床防治或通过抗体检测判断抗体的免疫中和作用意义可能不大。有报道指出,ALV引起感染鸡群最早出现临床肿瘤的时间是24日龄,但从国内大部分报道来看,大部分鸡只在60日龄前,症状不很明显,除少数出现鸡冠发白,消瘦和零星死亡外,绝大部分不表现临床症状。大部分鸡在开产前后(90~160d)出现明显症状如消瘦、冠发白、流血不止、表现肿瘤及较高的死亡率等。剖检可见一些组织异常如肝、脾肿大,甚至骨髓、内脏等出现肿瘤细胞。这些有助于AL的临床诊断,但此时进行确切诊断可能无法挽回造成的经济损失,且对已确诊的鸡只也没有很好的治疗方法,只能淘汰,因而建立早期的ALV的诊断方法是很关键的。对感染ALV的鸡进行各组织中病毒检测,发现不同组组织中检测出的病毒数量有很大差异。表6中通过引物设计和PCR扩增等核酸探针方法的检测结果表明,在感染鸡的肾脏、肝脏、脾脏中病毒检测率最高,而在免疫器官中检测率最低。通过ALV抗原检测试剂盒对蛋清和泄殖腔中的ALV抗原蛋白P27对应检测表明,蛋清中检出率要高于泄殖腔,且泄殖腔检出阳性的,蛋清检测大都为阳性。通过PCR核酸探针检测技术对鸡胚、雏鸡及青年鸡肝脏组织内ALV进行检测,发现感染鸡群在鸡胚、雏鸡和青年鸡中均可以被检测出(表7)。这些检测结果一方面说明该病主要通过垂直传播感染鸡群,同时也提示给我们在该病的诊断和净化防制中可通过种蛋、鸡胚以及鸡肾脏、肝、脾等作为检测对象。4病毒共感染对免疫抑制作用的影响近些年,在国内报道较多的是鸡白血病病毒与其他免疫抑制病毒共感染现象;其中,ALV亚型间共感染,ALV与REV、MDV、CIAV、REOV等共感染或多重感染均被多次报道。人工感染试验表明,单一ALV感染对鸡只疫苗抗体、细胞因子、淋巴细胞转化等的免疫抑制几乎没有显著的影响,产生肿瘤几率也相当低;但如果与其他病毒共感染,这种免疫抑制作用就非常明显,而且显著提高肿瘤产生的几率。例如,REV与ALV-J共感染时,鸡体内产生的针对ALV-J的抗体较单一感染ALV-J的感染鸡减少17%~31.25%,ALV-J的病毒血症滴度提高26%~51%,带毒时间也相应延长;另外研究指出两者共感染造成淋巴细胞转化能力、CTL对肿瘤细胞杀伤活性均出现较ALV单一感染明显下降,同时脾、肝等组织损伤程度及其病毒含量都有所增加。另外,ALV与MDV、CIAV人工感染的试验也得到证实。5elisa病毒核酸检测由于ALV是一种包括内源性在内的多种亚型的反转录病毒群,在临床上产生较强致病性的主要是外源性的ALV,该病毒在感染机体内增殖的似乎无规律可循,且内源性ALV亚型基因是与鸡的宿主基因表达的必需伴侣基因,因而在机体一些组织中经常出现内源性ALV亚型基因的表达,其表达产物对外源性ALV亚型的临床检测造成很大的干扰,甚至作出错误的判断,因而我国早期一些检测血液或泄殖腔的ALV抗原的方法对鸡群或鸡只是否感染外源性ALV进行判断不是非常可靠,必须通过特定的ALV亚型鉴别的方法来进行。近10年发展起来的检测方法颇多,但以分子生物学检测和细胞培养病毒分离技术为主。分子生物学检测技术以核酸探针和RFLP技术应用最多,此两种方法均通过设计合成的特异性核酸引物作为探针或片段,提取组织中的病毒cDNA,进行PCR扩增,对得到的目的片段进行回收、测序和比较分析,以对病毒进行定性分析。该方法特异性强,检测快速,无需无菌操作,缺点是不能批量检测样品,所需设备高。该方法广泛用于实验室诊断。通过细胞培养和ELISA抗原检测结合是一种能够批量检测、快速区分内源性与外源性ALV的方法。该方法把疑似感染鸡只的血浆或组织研磨无菌滤过液接种在24孔或92孔对数生长期的CEF和DF1上,病毒吸附2~12h后,维持培养7~9d,通过ELISA试剂盒检测培养上清中ALV抗原(P27)或利用免疫荧光吸附试验(IFA)检测培养细胞内特异性病毒抗原,以区分感染病毒的类型。该方法适用于ALV的流行病学调查和种鸡场的净化。早在1999年,我国一些研究人员试图通过对种鸡场进行净化而达到在我国鸡群中控制鸡白血病、消除鸡白血病的目的,前期取得较为满意的效果,但限于各种复杂的因素,没有达到预期目的。近几年不加节