肾安提取液对sz诱导糖尿病小鼠肾脏gf-

肾安提取液对sz诱导糖尿病小鼠肾脏gf-

糖尿病性肾炎（dn）是糖尿病的严重并发症之一。发病率约占题患者的35.40%，是现在pm患者死亡的主要原因。DN为难治病之一,已为国内外学者所公认。转化生长因子-β1(transforminggrowthfactorbeta1,TGF-β1)是目前比较公认的DN发生发展的核心因子,在DN肾小球细胞外基质的积聚及足细胞损伤中无发挥着重要作用。本研究主要探讨肾安提取液对DN小鼠肾组织TGF-β1表达的干预作用。肾安提取液amesTRIzolReagent(美国Invitrogen公司);RNA的逆转录试剂盒逆转录(TOYOBO公司,日本);SYBRGreenmix(TOYOBO公司,日本);免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(GENETECH公司);兔抗小鼠TGF-β1、迁黏蛋白(fibronectin,FN)及Smad7多克隆抗体(Santacruz公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(KPL公司)。8周龄雄性C57BL/6小鼠54只,清洁级,体质量18-22g[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,合格证号:SCXK(湘)2009-0004]。随机分为正常对照组、模型组、厄贝沙坦组、肾安低、中、高剂量组,每组各9只。适应环境1周后,禁食12h,将链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,美国Sigma公司)溶于pH4.8柠檬酸缓冲液中,除正常对照组外,均按150mg/kg单次性腹腔注射STZ,72h后尾尖取血,测血糖,血糖>16.17mmol/L者为建模成功。同时正常对照组腹腔注射等量无菌柠檬酸缓冲液。肾安提取液由黄芪甲苷(黄芪提取物)、淫羊藿苷(淫羊藿提取物)、1,8二羟基蒽醌(大黄提取物)(均购自中国生物制品检定所)按比例为:2.5∶1.8∶2.8配制,用0.3%羧甲基纤维素钠配制成0.3029mg/mL备用。腹腔注射STZ72h后,正常对照组、模型组小鼠灌服蒸馏水10mL·kg-1·d-1;厄贝沙坦组灌服厄贝沙坦(杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司)10mg·kg-1·d-1(蒸馏水稀释至10mL/kg);肾安各剂量组分别灌服肾安提取液2.272、4.544、9.088mg·kg-1·d-1(均蒸馏水稀释至10mL/kg)。持续4周。给药前及实验结束前1d,用代谢笼收集24h尿液,计24h尿量,考马斯亮蓝比色法测尿蛋白浓度,并计算24h尿蛋白量。给药前尾尖取血,采用全自动生化分析仪检测血糖、血肌酐(serumcreatinine,Scr);药物干预结束后用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,称重,摘眼球取血,同法检测血糖、Scr;取肾脏,去包膜清洗后精密电子天平称重,按下式计算相肾质量指数(KW/BW)=肾质量(mg)/体质量(g);取左肾用4%多聚甲醛固定,用于病理切片,右肾-70℃冰箱冻存备用。取100mg肾皮质,加入RIPA缓冲液,裂解肾组织,PMSF提取总蛋白,Bradford比色法测定蛋白含量。取组织蛋白100μg,经10%SDS凝胶电泳后,转移至硝酸纤维素滤膜上,5%的脱脂奶粉-PBST溶液室温封闭1h。加一抗4℃孵育过夜,PBST清洗3×15min,加入二抗,室温孵育1h。ECL系统显影,X线压片曝光,β-actin为内参照。用图像分析软件(UVItec,英国)对X线片上杂交条带进行灰度分析,确定X线片上杂交条带的相对吸光度值。染色具体操作步骤按试剂盒说明书进行。3μm厚的肾组织石蜡包埋块切片,脱蜡、水化,微波抗原修复10min;羊血清封闭,室温下20min;滴加1:100的一抗,37℃1h;生物素标记的二抗工作液,37℃1h;DAB显色。结果判定(半定量评分):随机选取10个不重叠视野(×200),采用HMIAS2000高清晰度彩色病理图文分析系统做半定量分析,分别计算阳性染色面积占1个视野面积的百分比,取平均值。取左肾皮质部修成0.5mm3的小块,用10%中性福尔马林及2.5%戊二醛混合固定液前固定,1%四氧化锇后固定,梯度乙醇脱水,包埋后切片,醋酸铀与枸橼酸铅双重染色,置于透射电镜下观察。每只小鼠随机取1份标本,每份标本在电镜下拍摄3个视野。每张图片中测量基底膜最宽处作为部位,取3张图片的平均值为每例动物肾小球基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)厚度值。用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。计量资料以表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析。肾安对质构及肾质及smad7蛋白表达的影响模型组及肾安低剂量组各有1只小鼠分别于第3周、第4周意外死亡。给药前,各组血糖与正常对照组比较,有极显著性差异(P<0.01),但与模型组比较,差异无统计学意义;各组尿蛋白定量与正常对照组比较,差异均无统计学意义。给药后,除正常对照组外,各组血糖、尿蛋白定量与给药前比较,有显著性差异(P<0.05,P<0.01);给药后,其它各组血糖、尿蛋白定量与正常对照组比较有极显著性差异(P<0.01);各药物干预组血糖与模型组比较,差异无统计学意义;各药物干预组尿蛋白与模型组比较,有极显著性差异(P<0.01),肾安高剂量组与厄贝沙坦组比较,差异无统计意义。见表1。各组肾质量指数、肾小球硬化指数与正常对照组比较有极显著性差异(P<0.01);与模型组比较,肾安高剂量组和厄贝沙坦组肾质量指数降低,有显著差异(P<0.05,P<0.01),两组间则无显著差异;各药物干预组肾小球硬化指数均显著改善(P<0.05,P<0.01),肾安高、中剂量组与厄贝沙坦组比较,两组间差异无统计学意义。见表2。各组TGF-β1mRNA与正常对照组比较,有极显著性差异(P<0.01);而厄贝沙坦组和肾安各剂量组与模型组比较均有显著降低(P<0.01);肾安高剂量组与厄贝沙坦组比较,两组间差异无统计学意义。见表3。正常对照组小鼠肾皮质TGF-β1蛋白水平很低,其它各组小鼠肾皮质TGF-β1蛋白显著表达高于正常对照组,有极显著性差异(P<0.01);药物干预各组TGF-β1蛋白表达与模型组比较,有极显著性差异(P<0.01);肾安高剂量组与厄贝沙坦组TGF-β1蛋白表达无显著性差异。见表4,图1。FN主要表达于系膜区、GBM及肾小管基膜,呈棕色。正常对照组FN染色较弱,染色面积极少;模型组及各药物干预组FN与正常对照组比较均有显著性差异(P<0.01);各药物干预组与模型组比较均有显著降低(P<0.05,P<0.01);肾安高剂量组与厄贝沙坦组比较,两组间差异无统计学意义。见表5。免疫组化显示,Smad7主要表达于系膜区、GBM基膜,呈棕色。正常对照组小鼠肾皮质Smad7蛋白表达很低;模型组表达则显著升高,明显高于正常对照组(P<0.01)。药物干预各组肾皮质Smad7蛋白表达显著低于模型组(P<0.01);肾安高剂量组与厄贝沙坦组对肾皮质Smad7蛋白表达无显著性差异。见表6。正常对照组GBM厚度均一,可见3层结构,足细胞是附着于GBM;模型组GBM增厚明显,呈均一性,足细胞减少、消失,GBM裸露;厄贝沙坦组及肾安各组,GBM均出现不同程度增厚,部分呈节段性,足细胞不同程度减少,足突融合;厄贝沙坦组及肾安高剂量组病变最轻。与正常对照组比较,模型组及各药物干预组GBM明显增厚(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,药物干预后,各组GBM厚度明显改善(P<0.05,P<0.01);肾安中、高剂量组GBM厚度与厄贝沙坦组无显著差异。见表7,图2。肾安提取液、化疗药物与肾相关性传统观念认为DM属“消渴”范畴,其病机为阴虚燥热。DN是DM最常见并发症之一,一直以来,许多学者把阴虚或气阴两虚作为DN的基本病机。然而,随着科学技术发展,诊断水平提高,降糖药物的广泛应用,大多数患者“多饮、多食、多尿”的糖尿病典型症状(阴虚燥热)早已被控制,或根本未出现,而肾脏损害仍逐渐发生。因此,越来越多人对以“阴虚或气阴两虚”作为糖尿病肾病的基本病机提出质疑。蛋白尿是诊断临床糖尿病肾病的最主要依据,刘罡等研究表明尿白蛋白排泄率与糖尿病中医证候之间存在固有的联系。进一步研究发现,24h尿白蛋白排泄与糖尿病患者肾虚证的发生发展密切相关。肾为先天之本,生命之根,肾阳对机体各器官起着温煦和生化作用,吴朝妍等认为肾阳虚贯穿DN始终。张琪等[6认为,肾气从阳则开,从阴则阖,肾阳虚衰,关门不利则水邪益甚,气损血行不利,必致瘀血内生,肾虚血瘀是DN病理基础。故我们以为本病以肾虚为本,气虚为基本证型,阳虚为发展趋势,瘀血始终贯穿其中。肾安提取液由黄芪甲苷(黄芪提取物)、淫羊藿苷(淫羊藿提取物)、1,8二羟基蒽醌(大黄提取物)组成,中医学认为黄芪温补脾肾,利水退肿;淫羊藿“补命门,益精气”;大黄既能活血祛瘀,又能通腑泄浊。全方益气温阳,活血化瘀,扶正祛邪,攻补兼施。现代研究表明,黄芪、水蛭黄芪配方含药血清均能阻止肾小球系膜细胞进入S期从而达到抑制增生的目的,且能提高其凋亡率。淫羊藿能扩张血管、降低血压,降低残余肾小球内压力,减轻高灌注、高压力对肾脏的危害。大黄可改善早期DN患者肾脏的高灌注、高滤过状态,延缓DN进展。笔者观察也发现,肾安提取液能减少DN小鼠尿蛋白排泄,改善肾质量指数及肾小球硬化指数,延缓肾损害。DN病理变化主要表现为以肾小球细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)增多为特征的系膜区增宽、基底膜增厚,进而出现肾小球硬化及肾小球入、出小动脉玻璃样变等病理表现。高糖及肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensionsystem,RAS)激活等导致的TGF-β1的表达增加,在DN的发生发展过程中发挥着关键作用。TGF-β1不仅能刺激系膜细胞活化增殖,分泌大量的胶原蛋白、FN及层黏蛋白等ECM成分;同时,还能促进这些细胞分泌基质蛋白降解酶的抑制物,抑制ECM成分降解。RAS阻断剂血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂能明显下调DM肾组织中TGF-β1mRNA和蛋白表达,并改善肾脏局部血流动力学异常,减轻DN病理变化,降低尿蛋白量,延缓肾功能损害等。我们的研究显示,肾安提取液不仅能明显降低DM小鼠肾皮质TGF-β1mRNA及蛋白表达,对肾组织FN合成及GBM的增厚也有显著抑制作用,而无明显降血糖作用,提示其作用机制不是通过降血糖来实现的。近年来的研究发现,肾小球足细胞的凋亡、脱落致足细胞的减少在DN大量蛋白尿和肾小球硬化的也起着重要作用。Smad蛋白是TGF-β1信号通路的重要下游分子,Smad7在介导足细胞凋亡过程中发挥着重要作用。TGF-β1可能通过促进Smad7的合成,进而抑制核因子-κB的转录活性,导致足细胞的凋亡。研究表明,TGF-β1能强烈诱导转基因鼠和体外培养的足细胞内Smad7蛋白的合成,且与足细胞凋亡程度存在明显相关性。本实验也初步观察到,由黄芪甲苷、淫羊藿苷、1,8-二羟基蒽醌组成肾安提取液,能明显抑制DN小鼠肾皮质Smad7蛋白表达,并减轻肾小球足细胞的损伤。我们认为其作用机制可能与该方抑制TGF-β1/Smad7信号通路转导,减少足细胞凋亡有关。因此,笔者推论肾安提取液可能通过抑制TGF-β1的表达,减轻ECM积聚,并抑制TGF-β1/Smad7信号转导,减少足细胞凋亡,从而对DM肾损害起保护作用。1.试剂2.老鼠模型的构建和组成3.给药4.采集样品、血液和尿液生化指标的测定5.高效液相色谱法按Trizol(美国Invitrogen)说明书提取各组肾皮质总RNA,并反转录成cDNA。引物序列采用PrimerPremier5.0软件设计。TGF-β1引物:上游:5,-TCCCTCAACCTCAAATTATTCA-3,,下游:5,-GCGGTCCACCATTAGCAC-3,,产物493bp,退火温度58℃;GAPDH引物:上游:5,-TCAACGGCACAGTCAAGG-3,,下游:5,-ACCAGTGGATGCAGGGAT-3,,产物470bp,退火温度