病理制片技术手册

病理制片技术手册第一章病理标本的接受

第二章组织固定

第三章取材

第四章组织脱水

第五章包埋

第六章组织石蜡切片

第七章常规染色

第八章封片

第九章冷冻切片的制作

第十章惯用特殊染色

第十一章惯用试剂及染液的配制第一章病理标本的接受

病理标本的接受是在取材、固定组织前首先要做的第一步工作，它是临床与病理科交接的一种重要环节，它为开展病理学检查、病理档案的保存奠定了基础。

标本接受程序以下。

1．首先核对病理申请单与标本上的红色号码与否一致。

2．核查病理申请单上写明的送检标本及数目与否与实际送检标本一致。

3．观察送检标本的大小及固定液比例与否适宜。

(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4％中性甲醛(10％中性福尔马林)固定组织的量应在6～10倍。

(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。

4．将病人姓名、性别、年纪、病历号、科别、临床诊疗、部位、标原来源、标本例数等逐项录入电脑存储。

5．作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，方便病理档案长久保存。

第二章组织固定

一、固定的目的和意义

活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织化学变化，并造成形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态变化直至腐败自溶。固定的目的就是要通过使用化学和物理的办法，尽量地保存组织细胞离体时含有的生理和病理形态构造及生物化学和免疫化学成分。

良好的固定是制作优秀病理切片的基础，也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术办法赖以成功的基础。

因此，在病理技术工作中必须高度重视固定的质量。

二、组织固定的注意事项

1．及时取材：由于甲醛对组织的平均穿透速度只有0.8mm/h，因此手术切除的送检标本应及时切开进行取材，方便确保重要的镜检部位能及时地得到固定。

2．及时固定：完毕取材的组织块应立刻投入固定液方便尽量地保存组织细胞的形态构造和抗原性。

3．液量充足：普通状况下规定固定液的量应为组织体积的6～10倍。

4．适度固定：当代固定的规定是，在良好保存组织细胞形态构造的同时尽量较好地保存组织细胞的抗原性。长时间的固定会造成某些组织抗原性的逐步丧失，因此，适时固定能够在保存细胞构造和抗原性之间获得必要的平衡。对于较大的送检标本而言，在及时切开固定的基础上，应尽量在24h以内取材进入组织脱水程序。

5．适宜温度：低温能够减少固定的速度，反之能够加紧固定进程。在自动组织脱水机上能够施加恒定的温度使得在有限的时间内能够完毕固定过程。普通状况下应将固定温度控制在36~38℃。

6．适宜搅拌：在自动组织脱水机上能够通过使用搅拌和试剂循环功效使固定过程在标本与试剂充足接触的条件下完毕。

三、固定液的选择

影响标本固定的因素诸多，如组织与固定液的比例、固定时间、固定温度等；除此之外，固定液本身也很重要，若所选固定液不当，细胞内蛋白质、脂类、核酸等成分将会有不同程度地损失。固定剂最佳随配随用，并注意其浓度和酸碱度。因此根据实际工作的目的，选用适宜的固定液非常重要。下面是某些惯用固定液的配制办法及合用范畴。

1．单纯固定液

(1)4％中性甲醛固定液：最惯用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。普通无特殊规定的病理标本均合用。特别值得注意的是，中性甲醛是以pH7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于普通的4％甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超出一种月。

甲醛(40%)100ml

无水磷酸氢二钠6.5g

磷酸二氢钠4.0g

蒸馏水900ml

(2)乙醇固定液：使用时以80％～95％的浓度为宜，含有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗入力较弱，因此极少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故惯用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用100%乙醇固定组织。

(3)4％的多聚甲醛：重要用于培养细胞的固定。

2．混合固定液

(1)乙醇一甲醛(乙醇－福尔马林，AF)固定液：合用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95％乙醇脱水。

甲醛(40％)100ml

95％乙醇900ml

(2)B5(醋酸钠一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀解决。

无水醋酸钠1.25g

升汞6.0g

蒸馏水90ml

使用前加入甲醛10ml

(3)Bouin固定液：特别合用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩极少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。

饱和苦味酸水溶液(约1.22%)75ml

甲醛25ml

冰醋酸5ml

(4)Carnoy固定液：穿透能力强，可较好的固定细胞质和细胞核，特别适合于固定外膜致密的组织，亦合用于糖原及尼氏小体的固定。

无水乙醇60ml

氯仿30ml

冰醋酸10ml

(5)Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较昂贵且需特殊解决汞。该固定液要避免接触阳光，以免引发化学变化而失效。

升汞5.0g

重铬酸钾2.5g

硫酸钠1.0g

蒸馏水(加至)100ml

四、操作办法

临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充足造成标本干涸或腐败，无法进行切片制作。病理科工作人员验收标本后，必须对临床初步固定的标本及时进行规范的解决：对于穿刺及胃肠镜所取的小标本，直接添加中性甲醛，添加的量应6～10倍于标本体积；对于较大的手术切除标本应呈书页状切开、有包膜的标本切开固定，切开的厚度1cm左右，为了保存标本的原有大致形态，切开时最佳不要完全断开，两切面之间用脱脂棉或纱布隔开，然后放人6～10倍体积的固定液中完全沉没。特殊标本特殊解决：如脾脏或淋巴结等包膜较厚，固定剂渗入力有限，应切薄薄的一小片单独固定，对于宫颈锥切标本及胃肠等空腔器官应及时钉板展开固定。固定到取材的时间应视标本的大小及切面的厚度而定，小标本应不少于4h,大标本不少于18h。

第三章取材

一、概念

取材是将送检标本进行客观描述并将病变部位组织切成厚薄适度的小片后装入小盒(进入组织脱水程序)，取材至关重要。

二、取材环境

取材室由取材台、统计桌、标本陈列架、电脑查询等构成；取材台应有良好的排风、进出水系统，配备齐全的刀、剪、镊、尺等基本工具和备用固定剂，统计桌应备有打号机(无时应用铅笔)、统计纸张、标本小盒及盒盖等，标本陈列架应寄存、拿取方便、排风良好，电脑查询应与登记台和医师诊疗统计成果的计算机相连。

三、操作

1．首先进行核对：统计者拿出一份申请并唱出病理号，取材医师按病理号拿出一份标本，核对无误后唱出申请单编号，统计者核对无误后念出申请单上填写的取材部位和送检标本份数及具体块数，取材医师核对无误后对标本进行具体描述。

2．对送检标本的观察和描述：可分为活检小标本(涉及经内窥镜获取的黏膜组织、浅表或深在部位的穿刺物、子宫腔刮取物、经微创手术由器官或肿瘤中切取的不完整组织等)和手术大标本。

(1)小标本检查：描述送检标本的数量(量少时精确计数)、大小(量少时精确测量，量多时聚堆测量体积)、色泽、形状以及质地等。

(2)大标本检查：①检查切除标本的手术类型。②测量标本的大小；描述标本的形状、色泽、有无包膜或被膜及质地，必要时(如内分泌肿瘤)要在切开标本前称重；带有脏器的标本还应注意检查病变与有关脏器的比邻关系。③按操作规范切开检查标本切面，如实性区

域观察色泽、质地、纹理、有无出血坏死以及肿瘤肉眼浸润深度和范畴；囊性区域观察囊肿壁的厚度、内外表面、内容物及其性状等。④注意各系统脏器大致检查的特殊规定。⑤必要时绘制简图阐明标本大致特点和解剖关系，也可进行表面及剖面摄影，以保存大致资料。

3．组织取材：按病理诊疗和研究的目的和规定，从标本上切取适宜大小和数目的组织块，供后续制片和显微镜下观察用于诊疗以及有关研究。取材的普通原则以下。

(1)认真地进行大致检查，精确选用病变部位。

(2)显示病变全貌，切取有代表性的病变区域组织，涉及病变周边相对正常的组织和坏死组织等；对有肿瘤的标本应涉及切缘、肿瘤包膜及转移部位等。

(3)组织块的面积普通为2.0cmX1.5cm，厚度不超出3.0mm。太大太厚的组织块常会固定不充足，而影响脱水和制片。组织块的数量依具体状况而定，普通以满足诊疗和有关研究需要为准。

(4)骨或钙化组织需要先经脱钙解决；腔道器官及囊壁组织应立埋。

4．统计：大致检查和取材要由含有一定经验的病理医师进行，应配备人员进行统计。统计人员负责以下事宜。

(1)每例标本在病理医师进行大致检查和取材前，与其共同核对该例标本份数、内容、病变特性及其标志与否与申请单有关内容一致。

(2)病理医师在进行大致检查和取材时，统计人员根据申请单向医师报告病人基本状况、术中所见、送检医师特殊规定等，并如实清晰地将病理医师口头描述统计于统计单上，必要时绘制简图显示大致所见及标示取材部位。

(3)病理医师取材完毕后，与其共同核算取材内容，确保组织块及其编号标签精确置人脱水盒内，并在统计单和取材工作单上签名并订立日期。

5．注意事项

(1)核对要认真，描述要客观，取材要精确。

(2)每例标本取材前后，均应用流水彻底清洗取材台面和全部有关器物，避免交叉污染。

(3)细小标本取材时可用伊红点染并用滤纸包裹，严防标本丢失。

(4)大标本取材大小要适宜(组织块的面积普通为2.0cm×1.5cm，厚度不超出3.0mm)

(5)取材刀刃要锋利，避免使用钝刀或齿镊过分挤压组织，取材动作要轻柔，不可来回切割或过分牵拉组织，以免组织构造变形或内部细胞脱落。

(6)组织块切面应平整，如有线结和钢丝应拔除。

(7)所取组织应涉及各脏器的重要构造或全层。

(8)特殊标本要在取材前摄影留资料。第四章组织脱水

组织经固定后会有大量水分，组织脱水是用某些溶剂逐步将组织内的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡的渗入。

一、手工脱水

1．器械准备：大标本缸6个，浸蜡用金属缸3个，脱水篮，恒温烤箱。

2．日常工作程序见表5．1。

表5．1手工脱水日常工作程序试剂浓度／温度时间设定中性缓冲甲醛4%3.00h乙醇80%1.00h乙醇90%1.00h乙醇95%过夜无水乙醇I

2.00h无水乙醇Ⅱ

2.00h二甲苯一无水乙醇体积比为1:130min二甲苯I

30min二甲苯Ⅱ

1.00h石蜡60℃1.00h石蜡60℃1.00h石蜡60℃1.00h

3．注意事项

(1)所用标本缸要大某些，达成组织块与液体比6～10倍。

(2)固定液、脱水剂要勤更换，能够采用前移更换。

(3)二甲苯时间不适宜过长，不要超出2h。

(4)石蜡温度不得高于60℃。

(5)全部程序应每间隔0．5h摇动2～3次以利于固定脱水浸蜡彻底。

二、半自动脱水机

半自动脱水机日常工作程序可参考全手工脱水日常工作程序进行。梯度乙醇的脱水时间加长。注意事项同手工脱水。

三、全自动密闭式脱水机

全自动密闭式脱水机有控制面板、解决槽、石蜡箱和试剂柜四个部分。为确保组织解决无刺激味道，全自动密闭式脱水机还设有活性炭过滤器。

(1)控制面板有显示屏和小键盘，可由此输入20个不同的解决程序，可设立解决时间和温度，可启动P／V循环(压力和真空交替)和混合循环，出现故障时有报警提示。

(2)解决槽是组织块进行解决的容器。

(3)石蜡箱可将熔化的石蜡保持在设定的温度待用。

(4)试剂柜装有解决试剂。

1．日常工作程序见表5．2。

表5．2全自动密闭式脱水机脱水日常工作程序溶液百分浓度

（％）时间设定温度

（℃）P/V循环（压力和真空交替）混合循环中性缓冲甲醛液42.00h35＋＋乙醇801.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

＋＋乙醇951.00h

＋＋乙醇1001.00h

－－乙醇1001.00h

＋＋乙醇1001.00h

＋＋二甲苯1000.50h

－－二甲苯1001.00h

＋＋石蜡

1.00h60－—石蜡

1.00h60＋＋石蜡

1.00h60＋＋石蜡

1.00h60＋＋

注：截止时间为1／8：00am

2．双休日工作程序：脱水程序及各试剂的所用时间及功效相似，只将截止时间调至3/8:00am即可。

3．外检小标本工作程序见表5．3。

表5．3全自动密闭式脱水机外检小标本工作程序试剂百分浓度

（％）时间设定温度

（℃）P/V循环（压力和真空交替）混合循环中性甲醛42.00h35＋＋乙醇801.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

＋＋乙醇10030min

－－乙醇10030min

－－乙醇10030min

＋＋二甲苯10020min

－－二甲苯10020min

＋＋石蜡

30min60－—石蜡

30min60－－石蜡

1.00h60＋＋石蜡

1.00h60＋＋

注：截止时间为1／8：00am

4．小动物组织工作程序见表5．4。

表5．4全自动密闭式脱水机小动物组织工作程序溶液百分浓度

（％）时间设定温度

（℃）P/V循环（压力和真空交替）混合循环中性甲醛42.00h35＋＋乙醇800.50h

－－乙醇950.50h

－－乙醇950.50h

＋＋乙醇950.50h

＋＋乙醇1000.50h

－－乙醇1000.50h

－－乙醇1001.00h

＋＋二甲苯10020min

－－二甲苯10020min

＋＋石蜡

0.50h60－—石蜡

0.50h60＋＋石蜡

1.00h60－－石蜡

1.00h60＋＋

5．大动物组织(如狗、兔、猴)：能够同外检组织使用一种程序。

6．脱水程序运行完毕后解决。

(1)先按泵出按钮将石蜡抽回缸内，再打开解决槽将组织块取出。

(2)将解决槽内及槽盖上的余蜡擦净。

(3)将底部中央过滤器螺丝拧开，将管道口的蜡擦净，拧紧螺丝。

(4)盖上盖后，按清洗按钮清洗。

7．全自动密闭式脱水机的注意事项。

(1)固定液每三天更换一次，组织块为600～800块。组织固定的好坏直接影响切片质量。为达成组织固定彻底的目的，可使用脱水机的P／V循环和混合循环功效，也可将温度定在38～40℃。

(2)梯度乙醇脱水剂每星期更换一次，组织块约为1000～1200块。办法是将第二缸的80％乙醇倒弃，后来的95％乙醇和无水乙醇依次前移。只将最后一缸的无水乙醇更换为新液。这样更换不仅节省了乙醇，更重要的是如果脱水剂全部更换为新液就会产生过脱水，组织发脆。通过几次脱水后的乙醇，浓度即使只减少了5％～10％，但脱水过程中置换出的细胞外液、组织液等可削弱乙醇的脱水能力。因此实际工作过程中须根据组织块的多少、脱水剂的使用时间合理设定脱水剂的脱水时间、P／V循环和混合循环功效。

(3)透明剂二甲苯10～15天更换一次。第一缸二甲苯倒弃，第二缸前移至第一缸，第二缸更换为新液。二甲苯起媒介作用，将无水乙醇置换出又使石蜡较好地浸入组织内。如果透明时间过长、强度过大(如P／V循环和混合循环全程使用)就会产生透明，以致组织发脆发干不利于切片。因此透明剂设定的时间、P／V循环和混合循环的使用要有机配合。

(4)所用石蜡要干净无杂质，熔点58～60℃。使用一定时间后，倒弃二甲苯含量过高的第一缸石蜡，将后三缸石蜡依次前移，最后一缸换新鲜石蜡。石蜡温度设定为60℃，这样的温度可避免小标本浸蜡因温度过高而发脆。

(5)脱水机要放置干燥通风房间，避免阳光直射显示屏。最佳配备一台不间断电源(UPS)，避免瞬间断电影响机器使用。

(6)使用全自动密闭式脱水机要避免过脱水，过透明。

第五章包埋

一、意义

组织块通过固定、脱水、透明、浸蜡等解决后，用包埋剂(如石蜡、树脂、塑料等)将其包制成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。不同的包埋办法有不同的规定，经包埋后，组织可达成一定的硬度和韧度，有助于切成抱负的薄片。

二、包埋环节

先将熔化的石蜡注入包埋托内(模具)，而后用镊子将通过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台上，用镊子轻按组织块，以达成组织块平整，盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同，选择大小型号适合的包埋托；有规定直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停半晌，以使组织在蜡凝时立住，达成立埋的规定。

三、注意事项

1．每次夹取组织块时，镊子用乙醇灯加热至温度适中。

2．包埋托内不要有水、碎蜡等异物，以免影响包埋质量。

3．包埋蜡的温度要控制好，包埋蜡的熔点应为58~60℃。

4．包埋蜡加入少量蜂蜡(蜜蜡)，能够增加韧度，利于切片。

5．夹取组织块放人包埋托内时，一定要注意包埋面。

6．包埋好的蜡块，用刀修整时，一定要适宜保存蜡块中组织周边的白蜡边，以利于持续切片。

7．每包埋完一块组织，镊子必须擦干净或用乙醇灯烧。

四、自动包埋机介绍

自动包埋机是对组织经脱水、浸蜡后进行包埋解决的设备。有多个类型，其设计含有人性化，普通整机由包埋部分和冷冻部分组合而成(一体化简洁紧凑)，全自动程序控制，含有延时自动开机功效，加热快速，温控精确，安全可靠，包埋效果好等特点，冷台最低温度可达一5℃，可进行快速冷冻解决包埋块，含有大冷台，冷冻面积大，可放置超大包埋盒或多个包埋盒。包埋部分温度能够从55～70℃，可储存3～5L石蜡，自动熔解石蜡，可容纳70～100个样品包埋盒。金属板表面容易清洗，有2个加热的抽屉，可收集多出的石蜡，进行重新运用，避免石蜡浪费。含有冷却镊子架，方便使用。可配放大镜利于小活检标本的包埋；可配脚踏：石蜡注入由脚踏开关控制或上手工控制。全部温度和工作时间参数全部由程序控制，记忆功效配有备用电池，这使病理组织学实验室的工作更为灵活。这种独特的结合使现在组织学和病理组织学实验包埋技术达成了新的水平。是创新发展的石蜡包埋技术和智能化高水准工艺的完美结合。

第六章组织石蜡切片

组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程为石蜡切片法。石蜡切片法现使用的切片机有平推式切片机、轮转式切片机两种。

一、平推式切片机石蜡切片法

1．切片前的准备：清洗过的载物片(或免清洗的)，毛笔，铅笔，小竹片，水槽，雾化器，摊片器，切片刀，刀架。

2．切片制作环节：刀架的粗削部放在头端，在切片机刀架部夹紧。组织蜡块装在切片机蜡块固定器上夹紧。右手握切片机刀头运动手柄，左手转动切片机蜡块运动旋钮。先转动此钮，后平拉刀架运动手柄，进行粗削，直至组织切全。停止，将刀架移到细削部，轻轻转动蜡块运动旋钮，后拉刀架手柄进行细削。削至组织光滑发亮，右手拿毛笔扫净刀架及蜡块上的蜡屑，组织屑，放下毛笔，再用右手握住刀架运动手柄。左手拿小竹片，用竹片头蘸一下水槽中的水。左手中指搬动薄切钮，雾化器的喷头对准蜡块。右手拉刀架运动手柄。左手中的小竹片在蜡块空白处等待切片刀切起蜡片一端挑起粘住，随切片刀移动，完整的蜡片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，捞片，放在摊片器上摊片5min后，装在染色篮上，放入75℃烤箱烤片。

3．注意事项

(1)无冷台的病理科能够将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间过久温度太低切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，背面的片子就会薄某些。

(2)雾化器是去除静电的，但也有增加切片厚度的缺点。特别雾气大时，使蜡块热涨，厚度增加更明显。为了确保切片厚度，一定要控制好风力、雾力。雾化器使用自来水，水位控制在30刻度。

(3)切片机使用前一定要检查各部位状况。先检查固定器与否固定在你所要的厚度上。切片机刀架角度与蜡块呈90。。从蜡块右上角进刀。

二、轮转式切片机石蜡切片法

1．切片前的准备：清洗过的载玻片、毛笔、铅笔、盛有30％乙醇的小烧杯、牙科镊、展片槽、切片机、一次性刀片及刀架。检查轮转式切片机切片厚度的钮与否固定于你所要切的厚度刻度上。

2．切片制作环节：将放在－5℃冷台上的组织蜡块装在切片机固定器上夹紧，空白蜡多的一端在上。将切片刀固定一端为粗削部，左手旋动蜡块推动器，右手旋动切片机把手。先摇动蜡块推动器，后摇动切片机机头半轮上下运动，进行粗削，一进一削，直至组织切全。而后将切片刀移至另一端进行细削，削至蜡块光滑平整。用毛笔将其刀架、蜡块面清扫干净。左手持毛笔，右手整轮转动切片机手柄进行切片。将毛笔贴于刀架背不时转动，轻轻托起连片的蜡片。右手停止转动机头，换持牙科镊，夹住连片蜡片头端，放入盛30％乙醇的烧杯内。用牙科镊去除不好的蜡片。放入水温45～50℃水槽内展片后捞片。

3．注意事项

(1)无冷台的病理科能够将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间久温度太低注意切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，背面的片子就会薄某些。

(2)为了能够连片，蜡块两端要有空白蜡。多的一端放在上面。

(3)展片槽温度不要过高，有时会有小组织块散漂在水面上造成污染。可用手纸折成与水槽宽度相似水面行走，将组织屑捞走。第七章常规染色

苏木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色办法，简称HE染色办法，是生物学、细胞学与组织学最广泛应用的染色办法。在病理科称为常规染色办法。病理学的诊疗都是以HE办法为基础的。染色的目的是把组织切片或细胞涂片等浸入染料及其它染色剂配成的染色液中，通过适宜的时间和解决，使组织或细胞及其它成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，从而便于光学显微镜下进行观察和研究。

进行染色迈进行染色液的配制，应根据工作量的多少配制对应量的染液，同时应注意溶液种类的选择、溶液浓度、pH值等，另外也应注意配方的合理选择。

在实际工作中，应做到下列几点。

(1)保持染液的清洁，应经常过滤或更换。

(2)染色时间应根据组织的种类、染液的新旧及特殊规定而决定。

(3)染色环境温度对染色效果也有着亲密的影响，故染色时间必须根据不同条件灵活掌握。

(4)脱蜡干净与否对染色效果有着重要影响，烤片温度、脱蜡二甲苯的温度、二甲苯的新旧和二甲苯脱蜡的时间长短都与染色有着亲密关联。

(5)标本脱水的好坏及固定的充足与否对染色效果影响极大。

(6)切片染色后，经梯度乙醇脱水，若每步的时间局限性易造成切片发雾、含糊不清，影响诊疗。

在染色过程中，既要按常规办法环节进行操作，也应根据实际状况、个人经验灵活运用，不停总结，才干纯熟掌握并提高实际工作能力与效率。

一、人工染色

人工染色已使用近百年，至今还在使用，既古老又实用。人工染色的设立因地区的差别设立也不同，但大多数的地方基本同样。

１．石蜡切片HE人工染色程序(见表8．1)。

表8．1人工染色程序液体设立１75℃恒温烤箱烤片20min２二甲苯I2～5min３二甲苯Ⅱ2～5min４二甲苯Ⅲ2～5min５无水乙醇I1min６无水乙醇Ⅱ1min７95％乙醇I1min８95％乙醇Ⅱ1min９85%乙醇1min1080%乙醇1min1170%乙醇1min12自来水水洗3次，将水控净13苏木精?5min14自来水水洗3次15l％盐酸乙醇分化3～5s16自来水水洗3次17O．5％氨水返蓝18自来水水洗3次191％伊红水溶液1min20自来水水洗3次2170%乙醇1min2280%乙醇1min2395%乙醇I1min2495%乙醇Ⅱ1min25无水乙醇I1min26无水乙醇Ⅱ1min27无水乙醇Ⅲ1min28二甲苯I1min29二甲苯Ⅱ1min30二甲苯Ⅲ搁置至封片

2．注意事项

(1)石蜡切片放入恒温箱中烤片，温度不可过低或过高，以75℃为宜，否则在染色过程中容易发生脱片。

(2)组织切片脱蜡要经二甲苯三次才干彻底。切片从恒温箱取出后应趁热浸入二甲苯以利于彻底脱蜡。使用一段时间后，第一缸二甲苯融的蜡较多应倒弃，其后的二甲苯依次前移，最后一缸换新鲜的二甲苯。

(3)切片经70％乙醇后入苏木精染液前，必须自来水水洗3次，最后1次最佳用蒸馏水水洗并控干。这样能够确保Harris苏木精染色能力持久，而不会由于低浓度乙醇的混合而过早的丧失染色能力。

(4)Harris苏木精染液配制的好坏直接影响切片染色质量。好的苏木精染液500ml正常染色能力为2500张左右。为确保染色质量应及时更换染液。

(5)苏木精染液要经常过滤以确保染色清洁而不在切片上有染色渣的出现。

(6)盐酸乙醇分化液配制参见本书第十二章。分化时间可根据分化液的新旧适宜调节，新的分化液时间短些。分化的目的就是让该染上要清晰地染上，而不该着色的一定要分化掉。

(7)氨水返蓝液浓度不可过高，返蓝时间不可过高，不要过长，否则会发生脱片现象。

(8)1％伊红水溶液是抱负的胞浆染液。要选择好水溶性的伊红染料使胞质鲜艳某些，切片不仅美丽且利于观片。

(9)切片染色后的脱水要充足，每道乙醇脱水的时间不要过短，特别是三道无水乙醇更为如此。无水乙醇要勤更换。

(10)切片经最后一次无水乙醇后尽快地放人二甲苯中。在夏季室内湿度较大的环境中更是如此。如切片在湿度大的空气中停留时间过长就会在封片时产生雾气，而不能现片。其因素是无水乙醇吸取了空气中的水汽，在二甲苯中难以分离析出，当用中性树胶封片后，二甲苯挥发，而水汽留在胶中产生雾气。

(11)封片所使盖玻片需大小适宜、清洁。树胶用量视盖玻片大小而定，规定不发生溢胶或缺如。

(12)不倡导切片经无水乙醇，然后干燥，直接用中性树胶封固。这样会产生人为的细小黑点，与细胞核相似。

(13)封片要在通风厨中进行，避免二甲苯污染工作间，危害技师的身体。

二、自动染色机

自动染色机是近几年才引进的病理自动仪器，在病理制片过程中发挥着重要的作用，它能够持续进行染色，自动记忆，染色效果好，质量控制到位。起到了手工无法比拟的作用。

1．液体设立：由于机器为电脑控制，染液次序及液体的设立根据染色机所设立的染色缸多少来调配。染色机基本模拟手工办法，运用机器手来完毕操作程序见表8．2。

表8．2机染程序的液体设立二甲苯二甲苯二甲苯无水乙醇无水乙醇95%乙醇85%

乙醇水水水水水烤箱65℃

停机报警取篮处二甲苯二甲苯二甲苯无水乙醇无水乙醇95%乙醇85%乙醇伊红1%

氨水1%

盐酸

乙醇苏木精装机

2．注意事项

(1)工作前先检查染液及试剂，并启动电源。

(2)启动进水开关。

(3)调试好所需的染色程序，根据苏木精一伊红的新旧来调节时间。

(4)将切片染色篮放人染色机后按提示键即可按程序进行染色。

(5)听到提示音响后，取出已染好的切片染色篮进行封片。

(6)工作完毕后，关闭电源，关掉水源，并盖好染色缸。

(7)染色机配制的无水乙醇及95％乙醇的程序比手工程序少，但不影响染色效果，因机械手在提高时有抖动作用，带的液体极少。

(8)定时取出活性碳过滤网晾晒确保使用。

(9)工作结束后一定要取出盐酸乙醇，以免长久放在机器内，腐蚀机器。

第八章封片

封片是将组织切片封固保存于载玻片与盖玻片之间，使之不与空气发生接触，避免其氧化、褪色，利于镜检观察及保存。

一、手工封片

手工封片应注意下列七点。

(1)所用树胶浓度要适中，以普通速度滴下并恰能成珠既可。太稀时易溢出玻片，当二甲苯挥发后，组织切片就会收缩产生胶不匀并出现大片气泡。太浓时，滴在玻片上树胶不易散开，易产愤怒泡，难以驱除，并影响折光率。

(2)树胶用量多少应根据组织大小、厚薄而定。

(3)应快速敏捷滴胶。

(4)封片时，切片上应保存适宜的二甲苯，以防干封，产愤怒泡。

(5)为避免气泡，封片时，树胶不适宜搅动。

(6)如遇有小气泡时可用镊子轻压盖玻片，排除气泡。

(7)封片时，若离面部较近，鼻、口呼出的气体会有水分造成切片云雾状甚至含糊不清，需引发注意。

二、机器胶带封片机

机器胶带封片机不用树胶，只用少量二甲苯即可封片。使用方便，切片诊疗后即可归档，不会因树胶不干造成粘片等。使用封片机时，首先检查二甲苯瓶，并检查滴液分注量，检查胶带可用量、选择胶带长短规格，检查接片筐与否安装到位。工作时开通电源，并打开过滤网开关。工作完毕后，关闭2个电源，擦拭机器。

三、机器盖玻片封片机

机器盖玻片封片机采用模拟人工手法来完毕封片工作。使用机器封片，封片效率高、质量好，同时可减少封片对技术人员身体的伤害。其操作环节为以下。

(1)接通电源，打开开关，机器进行白检后，批示灯变绿即可工作。

(2)将染色完毕的染色篮精确的放人封片机内。

(3)按动开始键，封片机进入工作状态。

(4)封片结束后报警，即可取出封好的切片。

机器盖玻片封片机的盖玻片采用24×40、24×50、24×60等规格的盖片(现在国产免洗盖玻片已替代进口，使用效果良好)。

第九章冷冻切片的制作

一、概述冷冻切片是运用物理降温的办法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术办法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊疗的良好办法。另外由于冷冻切片的标本是未经固定的新鲜组织，因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的抱负制片办法。冷冻切片的局限性是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。

二、冷冻切片的制作办法

运用氯乙烷喷洒、二氧化碳喷射、半导体制冷的办法均可制作普通的冷冻切片，用于术中的病理诊疗。恒冷箱冷冻切片机能够制作合用于多个目地的冷冻切片，是现在最为惯用的抱负冷冻切片制片方式。

1.冷冻切片的技术操作办法

(1)将恒冷箱冷冻切片机的速冻头和箱内温度调节到适宜的切温度，普通状况下为一18～一25℃。

(2)在标本冷冻托上涂布一层冷冻包埋剂一OCT，然后将取材后新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT覆盖标本。

(3)标本冷冻完毕后将标本托固定在切片机的机头上，调节机头位置使其正好位于切片刀的后方。

(4)使用粗切削方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面，使用自动推动方式持续切削2～3刀后用毛笔去除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。

(5)调节并确认切片的厚度，普通为4～8um，染脂肪和神经组织应控制在12~25um。

(6)放下防卷板使防卷板的位置正好与切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。

(7)以自动推动的方式进行切片，良好的切片将在防卷板的下方形成一张完整平整的薄片，如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。

(8)打开防卷板，用载玻片平稳地轻压切片使其平整地吸附到载玻片上。

三、冷冻切片的染色

切好的冷冻切片立刻投入丙酮中进行固定，普通固定1～2min即可进行染色，用于免疫组化染色的冷冻切片应在切片略干时即刻投入冷甲醇中固定10~15rmin然后进行对应的组织化学染色程序。

1．冷冻切片的HE染色程序。

(1)切片在丙酮中固定1～2min。

(2)水洗5s。

(3)使用新鲜的Harris苏木精染液染细胞核2min。

(4)水洗5s。

(5)在0.5％的盐酸乙醇液中分化1～3s。

(6)水洗5s。

(7)在0.5％～1％的伊红染液中染细胞质20~30s。

(8)水洗5s。

(9)在95％乙醇I、95％乙醇Ⅱ、100％乙醇I、100％乙醇Ⅱ、中逐级脱水各3～5s。

(10)甲苯I、二甲苯Ⅱ透明各5s。

(11)干组织周边的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光学树脂胶封片。

四、注意事项

1．倡导使用新鲜苏木精染色液：高质量的冷冻切片和良好的染色，是病理医师为在手术中的外科医师提供病理诊疗的重要手段。为了在短时间内获得高质量的HE染色冷冻切片，在确保高质量冷冻切片的同时使用新鲜的苏木精染色液是确保高质量染色的重要前提。

2.防卷板的调节：对的地调节使用冷冻切片机的防卷曲板是获得平展完整冷冻切片的重要手段，防卷曲板的对的位置是与切片刀

对的位置防卷曲板低于刀刃防卷曲板过于突出

的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板过分突出于刀刃会造成切片机头上的组织与防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃会造成切片向上卷曲不能形成平整的切片。在调试时可从下向上逐步提高防卷曲板的位置，每提高一点切一张切片测试，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。

3.避免污染：切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片进行粗切削完毕后必须用毛笔清理碎屑，以避免其它标本的组织碎片沾染到正在进行切片的标本上。

4．不同组织的切片温度调节：不同组织冷冻切片的冷冻温度调节原则是，柔软稚嫩富含水分的组织选择相对较高的温度，较为致密富含脂肪的组织选择相对较低的温度。柔软稚嫩富含水分的组织选择较低的温度易造成切片呈碎屑状，而致密富含脂肪的组织选择较

高的温度易造成切片堆积不能形成片状。详见表9·1。

表9．1部分组织冷冻切片的参考温度值冷冻温度组织一10～一15℃淋巴结、肾上腺、脑组织、脾脏、子宫内膜、黏液软骨－16～一25℃乳腺、肺、胆囊、子宫、小肠、结肠、肾、肝脏、肌肉、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺、扁桃体、软组织肿瘤一25～一50℃富于脂肪的乳腺组织、纤维脂肪组织、富于脂肪的皮肤组织、富于脂肪的肿瘤

第十章惯用特殊染色

一、六胺银染色

1．第一步准备工作：配制六胺银染液，将10％硝酸银2．5ml倒入干净的染色缸内，加入2％硼砂5ml，液体呈乳白色，再加入3％乌洛托品40ml，染液逐步呈透明状。

2．第二步染色过程：事先把温箱调至60℃备用，切片经脱蜡至水，用1％过碘酸氧化10min，水洗，然后切片放人六胺银染液放置60℃温箱1h，染真菌时间要相对短某些，普通状况下肉眼看到染液变色，切片呈棕色时从温箱取出染色缸，倒掉染液，自来水冲洗1min，用0．25％氯化金调色1min，水洗后，用3％硫代硫酸钠染5min,水洗，用苏木精染液浅染，水洗、分化、冲水返蓝，伊红染10s，最后经脱水、透明、封固。

3．图示成果：基底膜与毛细血管间质性物质、真菌呈棕黑色，核呈蓝色。

4．注葸事项

(1)掌握染色温度和时间，如60℃染1h，80℃染30～40min。

(2)真菌类染色时间相对要短，染色时间过长，切片染色过深，可用分色剂解决。

二、黏液卡红染色

1．第一步准备工作：配制黏卡染液，将称好的胭脂1g、氢氧化铝1g倒入瓶内，加入50％L醇100rnl混合摇匀，再加入氯化铝0．5g，水浴加温逐步煮沸并搅动液体，使其充足溶解(注意染液容易外溅)，数分钟后，染液由红色变成透明深紫红色，冷却后将液体倒入量筒，再加入50％乙醇至原量，过滤，放人冰箱备用。

2．第二步染色办法：染液使用时原液与蒸馏水比例为1：4稀释．

切片厚5um，脱蜡至水，经苏木精染色2min、水洗、分化、返蓝后进人黏卡液染色2h以上，染液能够重复使用多次，但要适宜延长染色时间．切片水洗后，脱水、透明、封固。

3．图示成果：黏液为红色，胞核为蓝色．

4．注意事项

(1)染液使用时比例为1份黏卡原液，4份蒸馏水。

(2)用酶消化对照染色特异性很大，消化时间为20min。

(3)配制黏卡染液时要避免液体溅出。

三、石碳酸品红染色

1．第一步准备工作

(1)配制盐基性品红饱和液：盐基性品红溶于乙醇内